甜樱桃花芽不同发育时期内参基因的筛选与验证

为了筛选甜樱桃花芽不同发育时期均稳定表达的内参基因,以甜樱桃桑提娜和黔樱一号不同发育时期花芽为材料,通过qRT-PCR技术检测28S rRNA、EF1-a1、EF1-a2、UBC、RPL13、18S rRNA、RSP3、CYP40、ACT2和α-TUB3等10个常用看家基因的表达水平,并利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper综合评价其表达稳定性。结果表明,EF-1a2和RSP3在所有样品中稳定性最好。分别以EF-1a2、RSP3及EF-1a2+RSP3作为内参基因检测不同发育时期花芽生长素运输载体AUX1基因及生长素响应因子ARF基因的表达模式,该2个基因在不同内参基因标定下表达模式相同。表明EF-1a2、RSP3及EF-1a2+RSP3可作为甜樱桃花芽不同发育时期的内参基因。     

低频声波频率下瘤背石磺CaM-like、CaMKII基因的表达及功能

长期栖息于潮间带的动物能够感知当地的潮汐规律,形成潮汐记忆的能力。本研究以栖息于潮间带的瘤背石磺(Onchidium reevesii)为对象,研究其通过感知潮汐来临时产生的低频声音来调节其行为与潮汐节律相协调的分子机制。通过RACE-PCR技术克隆到CaM-like基因的cDNA序列,并进行生物信息学分析和qRT-PCR实验。结果显示,瘤背石磺CaM-like基因的cDNA全长2321 bp,包括5′非编码区(UTR)366 bp,3′非编码区(UTR)1337 bp,618 bp的开放阅读框编码206个氨基酸;预测该基因编码的多肽链的原子数量是3165,分子量约为23029.64 kD,理论等电点4.64,分子式是C_(1018)H_(1544)N_(274)O_(320)S_9。N端信号肽由29个氨基酸组成。氨基酸序列比对构建系统进化树,结果显示瘤背石磺CaM-like基因与静水椎实螺(Lymnaea stagnalis)、光滑双脐螺(Biomphalaria glabrata)的CaM-like基因的亲缘关系最接近,这与传统形态学分类相吻合。在实验室内模拟潮汐中低频声音刺激瘤背石磺,应用qRT-PCR检测CaM-like基因在不同组织的分布情况,结果显示CaM-like mRNA在瘤背石磺不同组织均有表达,但神经节部位的表达量显著高于背部皮肤、腹足、肠、肝胰腺、口器和蛋白腺等组织(P0.05),推测其可能参与神经系统的可塑性调节。荧光定量结果显示CaM-like、CaMKII基因分别在25 Hz和50 Hz低频声波下刺激12.4 h表达量较高,初步推测其能感知25～50 Hz声波频率。这可能与栖息于潮间带中的瘤背石磺长期感知12.4 h半日潮潮汐周期节律,形成潮汐记忆有关。本研究将为进一步深入了解瘤背石磺感知潮汐节律的分子机制奠定基础,也为探究海洋动物由海洋向陆地进化过程中对环境的适应机制提供依据。     

通过GbF3’H基因单独沉默及其与GbCHI和GbDFR基因共沉默研究其在海岛棉中抗枯萎病功能

【目的】通过沉默海岛棉GbF3’H基因及共沉默GbF3’H、GbCHI和Gb DFR基因,研究其在海岛棉抗枯萎病中的作用。【方法】以海岛棉抗病材料06-146为研究对象,GhCLA1基因为阳性对照,空载体为阴性对照,构建海岛棉TRV2-Gb F3’H沉默载体,协同课题组前期构建的TRV2-CHI和TRV2-DFR载体,利用病毒诱导的基因沉默技术(Virus-induced gene silencing,VIGS)分别进行Gb F3’H基因单独沉默以及GbF3’H、GbCHI和Gb DFR这3种基因共沉默试验。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real time-polymerase chain reaction,q RT-PCR)分析各处理样品中基因沉默情况;设置室内接种枯萎病菌试验测定病情指数,分析各沉默材料对枯萎病的抗性差异。【结果】q RT-PCR结果显示,海岛棉GbF3’H基因沉默后其在海岛棉根、茎和叶中的表达量比空载体对照低,Gb F3’H、GbCHI和GbDFR这3种基因共沉默后其在海岛棉根、茎和叶中的表达量均比空载体对照低。病情指数调查结果显示,野生型<空载体对照相似文献   

花鲈cox6a基因与相关miRNA的鉴定及其在盐度适应中的表达调控分析

细胞色素c氧化酶（COX）是线粒体电子传递链的末端酶，COX6A是细胞色素c氧化酶的核编码亚基之一。为丰富花鲈（基因及相关miRNAs在花鲈渗透调节机制中的潜在作用，本研究开展了花鲈cox6a基因的miRNAs，并对其与）。系统进化树分析进一步确认了两个花鲈在垂体、脑、肝脏和肾脏中的表达量较高，基因的miRNA：miR-30e-5p、miR-223、miR-200a-3p和miR-155-5p，但没有发现可能靶定基因以及miR-30e-5p、miR-223、miR-200a-3p都呈现显著差异表达，而miR-155-5p仅在适应高盐环境时出现了显著的差异表达。这表明，基因和4个miRNAs在花鲈的渗透调节过程中发挥潜在作用。其中miR-30e-5p、miR-223和miR-200a-3p的表达趋势与cox6a2基因的表达调控。本研究为探讨花鲈适应不同盐度环境的渗透调节机制提供了基础数据。     

紫花苜蓿MsSQE1的克隆及对皂甙合成的功能分析

【目的】鲨烯环氧酶（squalene epoxidases,SQE）是苜蓿皂甙合成途径中的一种限速酶,与苜蓿皂甙的合成密切相关。通过对苜蓿鲨烯环氧酶（MsSQE1）基因的克隆及在苜蓿中过表达,探究鲨烯环氧酶对皂甙合成的作用机制。【方法】以模式植物蒺藜苜蓿鲨烯环氧酶基因序列设计引物,同源克隆苜蓿MsSQE1。对MsSQE1进行生物信息学分析;通过基因枪轰击技术,使MsSQE1在洋葱表皮瞬时表达,进行亚细胞定位。利用qRT-PCR方法分析该基因在根、茎、叶中的表达水平,以及在紫外辐射、ABA和GA₃条件下的表达模式。在茉莉酸甲酯（MeJA）的诱导下,分析MsSQE1的转录水平,及对苜蓿皂甙含量的影响。利用根癌农杆菌转化体系,获得过表达MsSQE1的阳性转基因植株,并测定转基因植株的皂甙含量。【结果】克隆了MsSQE1的cDNA序列,开放阅读框1 578 bp,编码525个氨基酸,等电点为8.59。同源性比对分析,其氨基酸序列与蒺藜苜蓿中SQE1氨基酸序列同源性为98.6%,与拟南芥的同源性为80%。亚细胞定位显示,MsSQE1可能定位于细胞膜。组织特异性表达分析显示,MsSQE1在叶中的表达量最高,茎中次之,根中的表达量最低。在紫外辐射、ABA和GA₃的诱导表达显示,紫外辐射诱导24 h,叶中表达量最高; GA₃（50 μmol·L ^-1）和 ABA（100 μmol·L ^-1）处理,均为8 h叶中表达量最高;MeJA处理能诱导MsSQE1表达量上调的同时苜蓿总皂甙含量也随着MsSQE1表达的上调而增加。分析过表达MsSQE1转基因苜蓿和转空载体苜蓿株系发现,MsSQE1的表达水平和总皂甙含量均升高,其中MsSQE1的表达水平是对照的3.11—9.45倍,总皂甙含量比对照提高14.26%—28.05%,暗示MsSQE1是苜蓿皂甙合成途径中的一种关键调节酶。【结论】从豆科牧草紫花苜蓿中克隆了MsSQE1并进行功能分析。在苜蓿中过表达MsSQE1能增加苜蓿总皂甙含量,暗示MsSQE1的表达影响苜蓿皂甙的生物合成,可能对皂甙的合成有重要的调节作用。     

白背飞虱酚氧化酶原PPO基因特性及其免疫应答

【目的】酚氧化酶（phenoloxidase,PO）是昆虫体内的免疫蛋白,在昆虫体内起重要的调节作用,主要以无活性的酚氧化酶原（prophenoloxidase,PPO）形式存在。本研究在转录组测序获得白背飞虱（Sogatella furcifera）3条PPO序列的基础上,通过分析白背飞虱体内不同SfPPO的发育和组织表达模式,并进一步抑制SfPPO的表达以及病原菌诱导,探讨SfPPO在白背飞虱体内的生物学功能。【方法】以白背飞虱3条SfPPO序列为研究对象,利用生物信息学方法分析其蛋白结构以及与其他昆虫之间的同源性。并以注射绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的dsRNA作为对照组,通过注射合成的dsSfPPO后采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测基因表达抑制效果;此外,为了探究SfPPO在白背飞虱生长发育和免疫应答方面的作用,利用qRT-PCR检测SfPPO在不同发育阶段及组织中的表达情况,以及注射大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）后3个SfPPO的诱导表达情况。【结果】SfPPO1、SfPPO2-1、SfPPO2-2的开放阅读框长度分别为2 079、999、2 070 bp,分别编码692、332、689个氨基酸,预测蛋白分子量分别为79.84、37.67、79.53 kD,等电点分别为6.43、9.56、6.20。生物信息学分析表明,白背飞虱的3个PPO蛋白具有较高的同源性,且与褐飞虱（Nilaparvata lugens）的亲缘关系最近;SfPPO1、SfPPO2-1、SfPPO2-2均在成虫第3天表达量最高,其中SfPPO2-1和SfPPO2-2的发育表达模式相似;SfPPO1和SfPPO2-1在表皮和脂肪体内表达量较高,而SfPPO2-2在翅和脂肪体内表达量较高,在头、足、中肠、马氏管中表达量相对较低;与注射dsGFP组相比,注射靶标基因的dsRNA后都能够显著沉默目的基因的表达,而且当SfPPO2-1表达被沉默后,SfPPO1出现显著高表达,说明不同的PPO之间可能具有补偿功能;大肠杆菌诱导后12 h,SfPPO2-1和SfPPO2-2表达量显著升高,SfPPO1表达量则在诱导24 h后显著升高;枯草芽胞杆菌诱导24 h后,SfPPO1、SfPPO2-1和SfPPO2-2表达量均显著升高。【结论】SfPPO1、SfPPO2-1、SfPPO2-2的表达存在组织和龄期特异性,且在不同菌诱导情况下存在免疫应答差异性。研究结果有助于更加全面、深入地探索白背飞虱酚氧化酶在调控昆虫发育及免疫中的潜在分子机理。     

橘色双冠丽鱼TYR基因的克隆及其发育时序和组织表达分析

酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)是动物体内黑色素合成信号通路中起关键性作用的限速酶,黑色素生成的速度和种类取决于TYR基因的表达量和活性水平.为了解色素相关基因与体色变化的关系,采用cDNA末端快速克隆技术(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术获得橘色双冠丽鱼(Amphilophus citrinellus) TYR基因cDNA全序列,并利用qRT-PCR分析了橘色双冠丽鱼体色变化不同时期和不同组织中TYR基因的表达差异.实验获得cDNA全长序列2 683 bp,其中阅读框1 620bp,编码540个氨基酸,5'UTR区246 bp,3'UTR区817 bp.氨基酸序列和系统发育分析表明,相比与脊椎动物间的保守性,TYR蛋白序列在鱼类间的保守性更高.qRT-PCR结果表明,TYR基因在胚胎各期均有表达,受精期表达量最低,血液循环期开始急速上升;在“黑色-灰色-亮黄色”三个典型体色褪黑过程中,各组织TYR基因表达量均在黑色期呈现最高值,显著高于灰色和亮黄色期,灰色到亮黄色时期鳞片和尾鳍的TYR基因表达量逐渐降低,但差异不显著(P＞0.05),而皮肤组织的TYR基因表达量在三个体色褪黑期均显著降低(P＜0.05);亮黄色时期,TYR基因在心、肾、脑、鳔、性腺、尾鳍和眼等组织均有表达,其中眼部表达量最高,其次是鳔和尾鳍,皮肤和性腺表达量最低.橘色双冠丽鱼TYR基因在三个典型体色褪黑期表达逐渐降低,可能与红色素细胞和黄色素细胞逐渐增多以及黑色素细胞数量和分布比例发生变化相关.本研究通过了解体色变异的分子基础,为鱼类体色遗传和体色改良研究积累资料.     

TaqMan探针双重实时荧光定量PCR法同步检测兰花中的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒

为建立一种同步定量检测建兰花叶病毒(cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(odontoglossum ringspot virus,ORSV)的高效检测方法,本研究根据CymMV和ORSV CP基因高度保守区分别设计引物和探针并筛选,获得156 bp和148 bp的靶标序列及对应的最优特异性引物探针组合,建立了基于TaqMan探针的双重实时荧光定量PCR方法。该方法最低检出限为1拷贝或6.2×10-3fg,最低稳定检出限为10拷贝或6.2×10-2 fg,是RT-PCR的10~100倍;构建的标准曲线线性关系良好,扩增效率分别为97.7%和100.2%,相关系数R2分别为1.000和0.999;对其他5种常见病毒均无扩增曲线,检测特异性强;批组内与批组间重复性试验Ct值变异系数≤0.60%,重复性和稳定性好。利用该方法和基因芯片法分别对4个种属的66个兰花样品进行方法验证,该方法相较于基因芯片法检出率提高了53.85%(CymMV)和162.5%(ORSV)。综上所述,本方法可同时高通量检测CymMV和ORSV 2种病毒靶基因,结果可靠,应用前景广阔,可为开展病毒精准鉴定、科学防控以及从源头遏制病毒传播提供技术支撑。