水稻细菌性条斑病菌拮抗细菌的筛选、评价与应用研究

从江苏省南京、泰州、扬州和宿迁等地区水稻田采集水稻病叶、健叶、根围土等样品90份,分离纯化得到1173个细菌分离物,对其进行水稻细菌性条斑病菌Xanthomonasoryzaepv．oryzicola皿内抑制试验,共获得12株拮抗能力较强的细菌,其中4株拮抗细菌抑菌圈直径大于27mm。盆栽试验结果表明,12株拮抗能力较强的细菌中有4株对水稻细菌性条斑病菌防效大于50％,其中菌株Lx-1l盆栽防效达62．5％。大面积示范试验结果表明菌株Lx．11田间防效达60．2％,显著高于化学药剂20％叶枯唑的防效（51．2％和45．8％）。形态特征、理化特性和分子鉴定分析确定菌株Lx．11为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens。     

热不对称PCR(TAIL-PCR)和Tn5转座子质粒拯救法快速分离水稻条斑病菌致病相关基因

构建植物病原菌突变体库是进行新基因发掘和功能基因组学研究的有效途径之一.为快速准确地鉴定Tn5的插入位点和相应的功能基因,研究采用热不对称PCR(TAIL-PCR)和Tn5转座子质粒拯救两种技术,鉴别了在筛选水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)Tn5插入突变体库过程中获得的8个在水稻(Oryza sativa)上毒性减弱的突变体.结果显示,TAIL-PCR和Tn5质粒拯救结合使用,可有效地鉴别Tn5的插入位点和相应的功能基因.TAIL-PCR鉴别的5株突变体是Tn5分别插入在分泌系统结构蛋白F基因(gspF)、cAMP调控蛋白、膜镶嵌蛋白酶酶原、S-蛋硫氨酸脱羧酶亚基和gspJ基因上;Tn5质粒拯救法鉴别的3株突变体是Tn5分别插入在致病性蛋白、功能未知的保守蛋白和鞭毛特异性ATP合酶基因上.序列同源性分析发现,8株突变体Tn5插入的基因与基因组测序的BLS256菌株中的对应基因同一性达100%.这表明,TAIL-PCR和Tn5质粒拯救技术可有效地应用于植物病原菌Tn5突变体库的鉴别和目标基因的分离.     

水稻条斑病细菌类Harpin蛋白的纯化与特性研究

 用硫酸铵沉淀、制备等电聚焦电泳、阴离子交换层析等方法从水稻条斑病细菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,Xooc) RS105菌株突变体M51菌体破碎液中纯化出可激发烟草产生过敏性反应(hypersensitive response,HR)的蛋白类物质,分子量约为25.5 kDa。该物质与梨火疫病菌(Erwinia amylovora))的HarpinEa和水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo)的Harpin_Xoo具有相似的生物活性和理化特性:可激发烟草产生典型的HR反应;对热稳定,对蛋白酶K敏感;RNA转录抑制剂放线菌素D、蛋白质合成抑制剂环己酰亚铵和钙离子通道阻断剂氯化镧能够抑制该物质激发烟草产生HR;该物质具有诱导烟草抗TMV的功能。据此,将该物质命名为类Harpin蛋白(Harpin-like protein,HLP_Xooc)。     

水稻黄单胞菌avrBs3/PthA家族基因研究进展

 水稻黄单胞菌白叶枯致病变种（Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo）和稻生致病变种（X.oryzae pv.oryzicola，Xooc）分别引起水稻白叶枯病（bacterial blight，BB）和水稻细菌性条斑病（bacterial leaf streak，BLS），对中国和世界水稻产量造成较大损失。基因组学揭示，Xoo和Xooc不同小种中存在15～30个数量不等的avrBs3/PthA（avr/pth）家族基因。新近研究结果表明，avr/pth基因既是毒性基因，又是寄主植物先天免疫的抑制因子，还是与抗病基因（R）匹配的无毒基因。Xooc中虽然存在avr/pth基因，但因存在能够抑制avr/pth无毒基因功能的抑制因子，故而未在水稻中发现抗BLS的R基因。除结构上的共有特征外，avr/pth基因间的差异主要表现在102 bp重复单元在每个avr/pth基因中的重复数多少上。avr/pth基因的进化可能由简单进化为复杂，这可能是Xoo和Xooc致病性变异的主要原因。     

黑龙江省稻稗对丁草胺的抗性测定及交互抗性的研究

【目的】明确黑龙江省水田稻稗(Echinochloa oryzicola Vasing)对丁草胺的抗药性水平以及对其他细胞分裂抑制剂的交互抗药性水平。【方法】采用琼脂法和整株盆栽法测定了黑龙江省14个地区53个田块的稻稗对丁草胺的抗药性以及对其他3种细胞分裂抑制剂丙草胺、苯噻酰草胺和莎稗磷的交互抗性。【结果】琼脂法检测出庆安03、东京城镇02等4个稻稗生物型对丁草胺产生了中等水平抗性，抗性指数为12.92~26.03，占供试稻稗生物型的7.55%；兴隆镇03、阿城04等4个稻稗生物型对丁草胺产生了低等水平抗性，抗性指数为6.63~8.86，占供试稻稗生物型的7.55%；庆安01、汤原01等5个稻稗生物型对丁草胺敏感性下降，抗性指数为3.18~4.84，占供试稻稗生物型的9.43%；其余阿城02、尚志02等40个稻稗生物型对丁草胺表现敏感，抗性指数均小于3，占供试稻稗生物型的75.47%。选取上述测定结果当中抗性最高的两个生物型，使用整株盆栽法进行对丁草胺的抗性水平验证。发现庆安03和东京城镇02同样产生了中等水平抗性，抗性指数分别为16.78和13.27；同时测定两个抗性生物型对丙草胺、苯噻酰草胺和莎稗磷3种细胞分裂抑制剂的交互抗性，结果显示，庆安03稻稗生物型对丁草胺和丙草胺产生了交互抗性；东京城镇02稻稗生物型对丁草胺、丙草胺和莎稗磷产生了交互抗性。【结论】黑龙江省部分地区稻稗对丁草胺产生了抗药性，且对丙草胺和莎稗磷产生了交互抗性。     

水稻细菌性条斑病种子劳菌检测技术研究：Ⅱ.离体检测法

 经3年研究建立了一套用离体稻叶检测稻种带细条病菌的方法，应用该方法成功地将44份自然发病的细条病病种接种到离体稻叶上并产生菌脓。甩1％水琼脂加90 ppm无毒苯口并咪唑．在30℃下可使水稻幼苗的离体叶保持15～20 d，可满足细条病接种发病的时间需要。应用纯菌测定该方法的灵敏度，最低可检测浓度为5×10^3 Cells／ml。由于选择了最佳的温度、湿度/光照、苗龄及其它有关环境条件， 使1．2～4．0 g的病种经研碎浸泡后浓缩针刺接种干离体稻叶上在3 d后出现病斑，5.5～8.5 d后产生菌脓，与其它血清学检测方法相比，离体检测法具有直观、可靠、简便、稳定等优点。特别可避免由于种子携带丧失活性的细条病菌或其它病菌而引起的误诊。     

黑龙江省水田稻稗对丁草胺的敏感性

利用滤纸法、琼脂法和整株盆栽法研究了黑龙江省10个地区水田稻稗对丁草胺的敏感性,结果表明：3种方法检测同一地区的抗性指数不同,但趋势相同。经比较,琼脂法最为快捷、不受时间和空间影响,可用于稻稗对丁草胺敏感性水平的初步筛选;整株盆栽法较为准确,可对筛选后可疑稻稗进行敏感性测定。整株盆栽法测定牡丹江地区稻稗对丁草胺的敏感性最低,ED50为I136．5750ga．i．／hm2,抗性指数为5．42,产生了低等水平抗性;其他地区抗性指数在1．00～3．00之间,处于敏感阶段。     

水稻条斑病菌avrBs3/pthA家族基因敲除体系的建立

水稻细茵性条斑病菌存在至少20个avrBs3/pthA家族成员,但其在水稻上的毒性或无毒性贡献并不清楚.本文依据avrBs3/pthA结构上的保守性,利用同源重组策略,借助自杀性载体pKMS1介导,对水稻条斑病菌中的avrBs3/pthA家族基因进行敲除.结果发现:同源交换可通过基因内和基因间重组实现avrBs3/pthA家族的基因敲除;PCR和Southern杂交结果显示,水稻条斑病菌中有5个avrB5s3/pthA家族基因被成功敲除,表明水稻条斑病菌avrBs3/pthA家族基因敲除体系构建成功.这为逐一评价avrBs3/pthA 家族基因的毒性或/和无毒性功能奠定了基础.     

The Twin-Arginine Translocation （Tat） Pathway Is Essential for Virulence,Flagellation, and Chemotaxis in Xanthomonas oryzae pv. oryzicola Strain RsGD42

Bacterial leaf streak, caused by Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, is an important disease of rice （Oryza sativa）. Genetic determinants （tatABC genes） of the twin-arginine translocation （Tat） pathway from X. oryzae pv. oryzicola strain RsGD42 were cloned and characterized, meanwhile, a tatC disruption mutant was generated. The tatC mutant lacked detectable flagella and was highly impaired in motility and chemotaxis. Furthermore, it was observed that the tatC mutant exhibited a reduced production of extracellular polysaccharide （EPS） and a significant reduction of virulence on adult rice plants compared to wild type strain. However, the tatC mutation in X. oryzae pv. oryzieola strain RsGD42 did not affect the growth rate and the ability to induce hypersensitive response （HR） in nonhost tobacco （Nicotiana tabacum L. cv. Samsun）. In conclusion, the data indicated that the Tat pathway significantly contributed to the virulence of X. oryzae pv. oryzicola.     

黑龙江省稻稗对丁草胺的抗性测定及交互抗性的研究

【目的】明确黑龙江省水田稻稗(Echinochloa oryzicola Vasing)对丁草胺的抗药性水平以及对其他细胞分裂抑制剂的交互抗药性水平。【方法】采用琼脂法和整株盆栽法测定了黑龙江省14个地区53个田块的稻稗对丁草胺的抗药性以及对其他3种细胞分裂抑制剂丙草胺、苯噻酰草胺和莎稗磷的交互抗性。【结果】琼脂法检测出庆安03、东京城镇02等4个稻稗生物型对丁草胺产生了中等水平抗性,抗性指数为12.92~26.03,占供试稻稗生物型的7.55%;兴隆镇03、阿城04等4个稻稗生物型对丁草胺产生了低等水平抗性,抗性指数为6.63~8.86,占供试稻稗生物型的7.55%;庆安01、汤原01等5个稻稗生物型对丁草胺敏感性下降,抗性指数为3.18~4.84,占供试稻稗生物型的9.43%;其余阿城02、尚志02等40个稻稗生物型对丁草胺表现敏感,抗性指数均小于3,占供试稻稗生物型的75.47%。选取上述测定结果当中抗性最高的两个生物型,使用整株盆栽法进行对丁草胺的抗性水平验证。发现庆安03和东京城镇02同样产生了中等水平抗性,抗性指数分别为16.78和13.27;同时测定两个抗性生物型对丙草胺、苯噻酰草胺和莎稗磷3种细胞分裂抑制剂的交互抗性,结果显示,庆安03稻稗生物型对丁草胺和丙草胺产生了交互抗性;东京城镇02稻稗生物型对丁草胺、丙草胺和莎稗磷产生了交互抗性。【结论】黑龙江省部分地区稻稗对丁草胺产生了抗药性,且对丙草胺和莎稗磷产生了交互抗性。