反硝化微生物分子生态学技术及相关研究进展

反硝化是微生物以氮氧化物作为电子受体产生能量的过程。由微生物推动的反硝化使地球生物圈中被固定的氮素重新回到大气中去,从而实现整个自然界的氮素循环。反硝化作用与人类的生产、生活密切相关,它能使江河湖海脱除氮素富营养化而得以净化,也能使农田氮肥反硝化流失造成重大经济损失。多年来,基于培养技术的传统微生物研究方法很难了解环境中的反硝化微生物,因为人们目前能够培养的微生物不足环境微生物总量的3%。近年来,分子生物学和现代生物技术的迅猛发展极大地推动了环境微生物学的发展,人们可以直接提取环境DNA、通过分子标记和多种技术研究环境微生物。本文综述了环境反硝化微生物的分子生态学研究技术及国内外相关领域的研究进展。     

土壤浸提液中硝酸盐氮氧同位素组成的反硝化细菌法测定

本研究优化了采用反硝化细菌法同时测定土壤浸提液中硝酸盐氮氧同位素组成的方法。在已有研究结果的基础上,通过采用5000~8000 r·min-1的转速离心、高纯氮气吹扫1 h、减少加样量及改造仪器自动进样器等措施对已发表方法进行了优化。对国际标准样品USGS34的分析表明,0.1~0.8μg NO-3-N样品量即可以得到较稳定、准确的测定值和校正值;同一时间内制备的硝酸盐δ15N的SD介于0.05‰~0.09‰之间,δ18O的SD介于0.28‰~0.48‰之间;在三个月之内δ15N和δ18O的测定值基本一致,表明该方法具有较好的准确度、精密度和稳定性。通过研究浸提剂、保存条件以及加热对测定土壤浸提液中硝酸盐氮氧同位素组成的影响,结果表明:常用的去离子水、KCl、Ca Cl2可能都含有微量的硝酸盐,随着加样量增大,浸提剂中含有的硝酸盐可能就会影响δ15N和δ18O的测定;对于土壤硝酸盐的浸提液,冷冻保存效果较好,保证了土壤硝酸盐氮氧同位素的准确性和稳定性;尽管加热对硝酸盐标准样品USGS34和IAEA-NO3的δ15N没有显著影响,但δ18O显著升高,说明加热易引起氧同位素分馏;而土壤硝酸盐浸提液样品加热前后的δ15N和δ18O的测定值没有显著变化,因此为避免产生氧同位素分馏和节省测试时间,建议同时测定土壤浸提液硝酸盐δ15N和δ18O时直接和反硝化细菌反应。应用本方法对不同肥料处理田间土壤浸提液硝酸盐的氮氧同位素组成进行了测定。     

好氧反硝化菌筛选方法的研究进展

好氧反硝化菌是一类可利用好氧反硝化酶,在有氧条件下进行反硝化作用的细菌。与传统的细菌缺氧反硝化脱氮相比,利用好氧反硝化菌发展好氧脱氮技术具有独特优势。笔者就好氧反硝化菌间歇曝气法、酸碱指示剂法、呼吸抑制剂法、选择性培养基法、滴加试剂法、极限稀释法和综合筛选法等筛选方法及其机理,进行了系统综述,并对其未来的研究趋势进行了展望。     

长期施肥对土nirS型反硝化细菌的影响及其与N2O排放的关系

土壤反硝化作用是土壤N₂O产生的重要过程,亚硝酸盐还原酶(NIR)催化的亚硝态氮(NO^-₂)还原为一氧化氮(NO)是反硝化作用的关键环节,研究长期施肥对反硝化微生物的影响及其与N₂O排放的关系对于全面理解土壤反硝化过程具有重要意义。基于28年的旱作雨养长期施肥试验,通过常规监测、定量PCR和高通量测序等探讨了长期不同施肥(不施肥CK、偏施肥的单施氮肥N和氮钾配施NK、以及氮磷钾平衡施肥NPK)下土N₂O排放和nirS反硝化细菌群落特征及两者之间的关系。结果表明:长期化肥施用(N,NK和NPK)均显著提高了N₂O累积排放量,其中平衡施肥(NPK)最高。长期化肥施用对nirS基因丰度和nirS型反硝化细菌的α-多样性无显著影响,但长期平衡施用化肥提高了uncultured_bacterium_2303和Rhodanobacter_sp._D206a的相对丰度,降低了unclassified_k_norank_d_Bacteria和unclassified_p_Proteobacteria的相对丰度,从而改变了nirS型反硝化细菌的群落结构组成。雨养旱作条件下,土壤有机碳(SOC)、全氮(TN)、有效磷(AP)和pH等土壤性质是土nirS型反硝化细菌群落结构组成变化的主要影响因素。土nirS型反硝化细菌群落结构组成对土壤N₂O排放具有显著影响,而nirS基因丰度和nirS型反硝化细菌多样性并没有显著影响。     

罗非鱼循环水养殖系统中一株肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及其脱氮性能研究

实验从山东德州市一罗非鱼(Oreochromis niloticus)养殖场循环水养殖系统的脱氮池中分离到一株具有高效脱氮特性的菌株(编号DZYC02),分别以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、丁二酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠为碳源,研究了碳源种类对菌株DZYC02脱氨氮效果的影响;同时以蔗糖为碳源、NH4Cl为氮源,研究了不同碳氮比、初始pH及盐度对该菌株脱氮效果的影响。结果显示:菌株DZYC02在以柠檬酸钠为碳源、C∶N≥15、pH 5~7、盐度0~15的条件下具有良好的脱氮效果,24 h内对浓度为20 mg/L的NH+4的去除率达100%,48 h内对浓度为20 mg/L的NO-2去除率高达100%;将该菌采用浸泡方式感染斑马鱼(Danio rerio)进行生物安全试验,结果显示菌株DZYC02对斑马鱼表现出较好的安全特性。分别用Biolog细菌鉴定方法和16S rDNA序列分析比对法对该菌进行鉴定,结果显示菌株DZYC02为一株肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。     

牛粪堆肥中反硝化细菌与理化参数的关系

以nos Z基因为标记,应用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳法(PCR-DGGE)对牛粪堆肥过程中反硝化细菌群落结构进行研究,通过冗余分析(Redundancy analysis,RDA)法,分析反硝化细菌群落结构变化与堆肥过程中理化参数(堆体温度、pH、含水率、氨态氮和硝态氮)之间的关系。结果表明,反硝化细菌群落的Shannon-Weaver指数在堆肥0~4 d升高,在7~29 d减小。对优势条带进行测序发现Alcaligenes存在于整个堆肥过程中,判定其为此过程中优势菌属。反硝化细菌群落结构在堆肥前期(0~4 d)变化较小,而在降温腐熟期(23~29 d)变化剧烈。皮尔逊相关系数分析表明,反硝化细菌群落多样性与含水率呈极显著正相关关系(r=0.960,P0.01),与温度呈显著正相关关系(r=0.766,P0.05)。     

Micro flora related to the nitrogen cycle in the tropical upland farm soils

Samples of upland-farm surface soils (0–10 em in depth) belonging to various great soil groups were collected in 28 upland sites in Thailand during the rainy season.

Among the microbes related to the transformation of nitrogen, namely ammonifiers, ammonia oxidizers, nitrite oxidizers and denitrifiers, the count of denitrifier showed the maximum value amounting to 10⁴ to 10⁵ per 1 g of dry soil, followed byammonifier. The population level of nitrogen-fixing blue green algae was unexpectedly high, being 10³ to 10¹

The microbial counts in Brown Forest Soils, Rendzinas and Grumusols with high content of organic matter, available phosphorus and exchangeable potassium tended to be high.

Non-calcic Brown Soils, Reddish Brown Lateritic Soils, Alluvial Soils, Red-Yellow Podzolic Soils and Gray Podzolic Soils which lack in some nutrients showed intermediate levels of microbial populations, while the counts of nitrogen-fixing blue green algae in Alluvial Soils and those of denitrifier in Red-Yellow Podzolic Soils were markedly high. In the case of Low Humic Gley Soils and Regosols with low content of organic matter, available phosphorus and available potassium, the population of microbes was generally small.

The relationship between the organic matter content and the microbial population of soils was positively significant at 0.1 % level only in the case of fungal population (r=0.551), while the relationship between the available phosphorus content and the microbial population was positively significant at 0.1% level only in the case of Azotobacter (r=0.682).

The relationships between the total nitrogen, the exchangeable potassium, the amount of NH₄+^-N, the amount NO₂ ^--N, or the amount of NH₄ ⁺-N+NO₂ ^--N and each microbial population were not significant in any microbial groups.

The count of denitrifiers in upland farm soils of Thailand was 9 times as high as that in non-volcanic upland-farm soils of Japan and was 23 times higher than that in volcanic soils though large variations were seen among the great soil groups of Thailand. Conversely, the population of non-spore-forming nitrite oxidizers in the upland farm soils of Thailand was 1/100 that in non-volcanic soils of Japan and 1/280 that in volcanic soils. In the case of Azotobacter, the count in upland farm soils of Thailand averaged 2,800 per 1 g of dry soil. while that in non-volcanic upland farm soils of Japan was 77 on the average.

The ratio of aerobic bacteria to actinomycetes in upland farm soils of Thailand was 2.31, while that of non-volcanic soils of Japan was 7.28.     

模拟氮沉降对贝加尔针茅草原土壤氮转化微生物的影响

草地土壤是温室气体重要的源和汇,认识草地生态系统氮转化过程有助于预测氮循环对未来氮沉降增加的响应与反馈机制。依托于2010年在内蒙古贝加尔针茅草原设置的长期模拟氮沉降增加的氮添加试验,共设置了8个氮添加水平(0、15、30、50、100、150、200、300 kg N·hm~(-2)·a~(-1))。应用荧光定量PCR方法,研究氮转化功能基因丰度对不同氮添加水平的响应。2015年8月取样分析结果表明:固氮微生物(nifH)基因丰度随着氮添加水平的升高,表现为先升高后降低的趋势。低于200 kg N·hm~(-2)·a~(-1)硝酸铵处理有利于固氮菌生长。低氮添加(N15、N30和N50)对氨氧化细菌(AOB-amoA)和氨氧化古菌(AOA-amoA)基因丰度无显著影响。高氮添加(N100、N150、N200和N300)显著提高了AOB基因丰度,降低了AOA基因丰度。高氮添加(N150、N200和N300)显著降低了nirK基因丰度。随着氮添加量的增加,高氮添加促进了AOB主导的氨氧化过程,而反硝化微生物丰度的减少提高了氨氧化产物硝酸盐的积累,继而提高了土壤硝酸盐含量。     

高效好氧反硝化茵的紫外诱变育种

采用紫外诱变法对好氧反硝化菌A762进行诱变处理,根据显色圈大小（G）与菌落直径（c）之比,初筛得到8株突变菌,再根据脱氮效果,从中复筛出1株总氮（TN）去除率最高的突变株B25,并对其好氧反硝化性能进行了研究．结果显示：紫外诱变96h后,在好氧条件下,相对于原菌株A762,菌株B25具有更好的生长优势,对NO3--N去除率达到90％以上,远高于原菌的22．201％;能短时间内去除积累的亚硝态氮,TN去除率提高到84．627％,比原菌株A762提高了60．071％．在反硝化过程中,培养液pH值逐渐上升,而氧化还原电位（ORP）逐渐降低．虽然诱变株B25有较强的反硝化活性,但还要进一步研究其在养殖水体中的脱氮效果,以便能得到实际应用．