转基因甘蔗BtG-2的T-DNA侧翼序列分析及其转化事件特异性检测

转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明：Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。     

灰海马染色体制备及核型分析

为了解灰海马的细胞遗传学特征,便于今后开展灰海马的种质评价与鉴定、规模化人工繁育、亲缘关系研究及人工选育等工作,实验以雌雄灰海马的背鳍为材料,采用秋水仙素浸泡和常规热滴片法制备染色体标本。借助Photoshop图像软件,将同源染色体配对、拼贴,做出染色体核型图。采用Image J软件的自定义曲线测量功能,以着丝粒的中心位置为起点,顺着染色体弯曲的形态,到染色体臂末端为终点,测量线段长度,得出图片中染色体的臂长,根据相同放大倍数下标尺的测量值,换算出染色体的实际臂长。根据臂比值,将染色体进行配对、分类后,得出灰海马的染色体核型公式。结果显示,灰海马的背鳍组织可作为其染色体制备的理想材料,实验选用的染色体制备方法能获得图像清晰、形态良好的细胞分裂相。此法简单、效果好,解决了海龙科鱼类染色体制备的难题;灰海马具有22对染色体,二倍体染色体数目2n=44,雄鱼的染色体核型公式为2n=2sm+20st+22t,雌鱼的染色体核型公式为2n=1m+2sm+20st+21t,雌鱼存在性染色体异型的现象,因此灰海马的性染色体为ZW/ZZ型。     

应用枇杷二代测序数据进行染色体步移研究

【目的】枇杷基因组数据尚未公布,限制了枇杷分子生物学的研究。当前很多研究集中在上游转录因子和下游基因启动子之间的调控关系上,所以获得目的基因的启动子显得尤为重要。传统方法使用PCR方式进行染色体步移来获得启动子区域,耗时且难出结果。【方法】对‘火炬’枇杷进行二代测序,二代测序为双端测序,片段含盖200到500bp的序列。根据下游基因序列通过测序片段来实现染色体步移。使用现有程序Magicblast和新开发的Promoter_Scan脚本程序来快速获取目的基因启动子区域。Promoter_Scan对每对Reads构建10 bp的索引序列,先使用索引匹配目的基因,匹配后使用目的基因前30 bp序列再次匹配目标Reads,最后完成拼接。【结果】通过二代测序共获得61.77 GB的‘火炬’枇杷基因组数据,测序深度约为85倍。使用Magicblast检索匹配Reads耗时长,难以二次开发,需要手动拼接延伸,每个基因启动子挖掘需要9.5 h。新开发Promoter_Scan脚本程序通过两次匹配,能够更快更准确地找到启动子序列。对枇杷中8个基因进行启动子查找,向上延长2 000 bp序列平均需要拼接11.7次,耗时21.3 min。根据步移后的序列设计引物进行验证,结果显示:Sanger测序结果和预测的序列高度一致。【结论】使用Magicblast检索方式能够达到实验要求,不需要编程技能,但是耗时长。Promoter_Scan能够实现自动延伸,显著缩短启动子挖掘时间。本研究中的两种方法不仅可以用于枇杷分子生物学的研究,对其他未公布基因组数据的物种同样适用。     

红花CDPK基因家族的鉴定及表达分析

钙依赖性蛋白激酶(CDPK)是植物细胞内Ca²⁺信号识别及转导的重要媒介，在植物的生长发育以及逆境响应过程中起着重要的作用。本研究通过多种生物信息学的方法和手段，对鉴定出来的30个CDPK基因进行分析鉴定，结果显示30个CtCDPK基因所编码的氨基酸分子量为47 781.96～93 251.66 ku,等电点为5.09～9.27;基因结构预测结果表明，所有CtCDPK基因均含有6～13个外显子；染色体定位结果表明，30个CtCDPK基因分别定位在10条染色体上，其中8号染色体上最多，有5个，2号、4号染色体上没有；系统发育树分析结果显示将其分为6个亚家族；表达分析结果表明CtCDPK基因在不同组织、不同发育阶段中表达模式有所差异。     

马铃薯Y病毒病与根结线虫病发生关系研究

[目的]探讨适合昭阳区的有效防治马铃薯Y病毒(PVY)和根结线虫的生物药剂,降低PVY和根结线虫病对烤烟生产造成的损失。[方法]通过防治根结线虫病的4种药剂和防治马铃薯Y病毒病的3种药剂之间的随机组合进行2种病害间的联防,研究根结线虫的发生对PVY发病率和病情指数的影响。[结果]得出3种最优组合:一是在施用0.5%肯邦线尊颗粒剂(0.5%阿维菌素)作为防治根结线虫病的前提下,后期施用克y特灵(5.6%嘧肽吗啉胍)作为防治马铃薯Y病毒病的药剂,病情指数表现偏低;二是在施用金东旺(阿维·丁硫)作为防治根结线虫病的前提下,施用宁南霉素(8%菌克毒克水剂)作为防治马铃薯Y病毒病的药剂,病情指数表现偏低;三是在施用金东旺作为防治根结线虫病的前提下,施用超敏蛋白(3%微粒剂)作为防治马铃薯Y病毒病的药剂,病情指数表现偏低。[结论]根据研究结果,一方面马铃薯Y病毒病和根结线虫病应分别防治;因为烟草马铃薯Y病毒病在没有根结线虫的情况下照样发生,所以需改变防治根结线虫病的同时也达到防治马铃薯Y病毒病的想法;在2种病同时严重发生的地域,更应重视2种病的同时防治。另一方面根结线虫的存在会加重马铃薯Y病毒病的发生。     

超级稻全程机械化绿色模式攻关试验

对Y两优900超级稻采用全程机械化绿色模式进行生产,探讨这种生产模式对Y两优900的主要农艺性状及产量的影响。结果表明,超声波处理可提高种子发芽率和秧苗素质,提高了最高苗数,增强了根系的发达程度,提高了有效穗数、每穗总粒数、每穗实粒数和结实率,综合年增产效果显著。     

自然环境下苹果作业机器人双果重叠目标侦测方法

为进一步提升苹果的侦测精度,从而提高苹果作业机器人的果实作业效率,以果园重叠苹果为对象,研究了自然环境下双果重叠目标的机器侦测方法。首先将采集到的苹果图像在Lab色彩空间中利用K-means聚类算法提取重叠苹果目标区域;其次在得到重叠苹果边界上的Harris角点后,通过关键角点检测算法定位苹果重叠部分的果实轮廓所在区域,并利用Canny边缘检测算子提取出苹果重叠部分的果实轮廓;然后利用Y型节点搜索算法实现重叠苹果目标的单果轮廓分离,并得到未遮挡果实的完整轮廓;最终利用距离最小二乘算法对被遮挡苹果目标进行果实轮廓重建。为验证方法的有效性,将Hough变换法、Spline样条内插法的重叠果实侦测结果与本文方法所得结果进行对比。试验结果显示,本文方法不仅可以侦测出未遮挡果实的完整轮廓,同时对被遮挡苹果目标也有较好的轮廓重建效果,其果实平均重合度和定位误差分别为95.43%和4.44%,侦测性能明显优于前两种方法,表明本文方法可以较好实现自然环境下苹果双果重叠目标的侦测,该结果为苹果作业机器人多果重叠目标的自动化侦测提供参考。     

两种方法分析大鳞鲃染色体核型的比较研究

染色体核型分析是细胞遗传学研究的主要内容。为了获得准确、便捷的染色体核型分析方法,以引进耐盐碱品种大鳞鲃为实验材料,取头肾细胞冷滴片法制备染色体标本,采用E-ruler测量软件和Photoshop图像软件结合完成了染色体核型分析,并与常规方法的测量结果、核型分析进行了比较。结果显示,E-ruler软件与常规方法对伸展平直染色体的测量无显著差异,前者对弯曲形态染色体的测量结果更为准确;Photoshop图像软件能剔除染色体中期分裂相照片的背景,准确判断着丝粒的位置,快速、便捷地完成染色体核型图拼贴。研究表明,利用E-ruler软件和Photoshop软件相结合可获得准确、清晰的核型分析结果,本方法适用于其他鱼类和生物的染色体核型分析。染色体分析结果显示,大鳞鲃的染色体组为二倍体,未发现与性别有关的异型染色体,核型公式为2n=100=12m+38sm+38st+12t,NF=150。同鲃科其他鱼类的核型相比,大鳞鲃与国内几种倒刺鲃核型类似,具有鲃亚科进化核型特征。     

抗马铃薯Y病毒病的VIGS生防剂发酵条件及施用方法优化

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silence,VIGS)是植物病毒病防治方法之一,能够有效防治马铃薯Y病毒病。以VIGS表达载体发酵液对烟草马铃薯Y病毒病的防治效果为检测指标,筛选最佳发酵液发酵所需的培养基、发酵条件和施用方法。结果表明:VIGS表达载体发酵液最优培养基是YEP培养基;最优发酵条件为装瓶量60 m L/200 m L、初始p H 7.0、培养温度30℃、振荡培养24 h;施用方法以"原液稀释100倍"、"剪叶后喷施+移栽时灌根"和"含PVY CP和HC-Pro基因片段的VIGS载体发酵液混合使用"的施用效果最佳。上述结果为抗马铃薯Y病毒病的VIGS生防剂发酵提供了理论依据,也为其田间应用打下基础。     

山核桃水溶性成分中神经营养活性因子的分离与鉴定

本研究旨在揭示山核桃水溶性成分的神经营养活性及活性因子。利用脱脂山核桃水溶性提取物处理SH-SY5Y细胞,用倒置相差显微镜观察细胞突触生长,用q PCR检测相关基因表达,使用HPLC及LC-MS对山核桃水溶性成分神经营养活性因子进行分离鉴定。结果显示,山核桃的水溶性成分能够显著促进SH-SY5Y细胞的突触生长,并可以显著上调SH-SY5Y细胞NF160基因的表达。HPLC及LCMS检测结果发现其水溶性成分主要组成为胞苷、尿苷、鸟苷、腺嘌呤、腺苷等。由此可知,山核桃水溶性成分通过上调NF160基因表达具有神经营养活性。