糯玉米SSR-PCR反应体系优化及多态性引物筛选

用L25(56)正交设计建立和优化糯玉米SSR-PCR反应体系;利用370对SSR引物对糯玉米两亲本及F1进行扩增,筛选抗丝黑穗病的相关引物。结果表明:20μL糯玉米SSR-PCR最优反应体系为1.5 U DNA聚合酶,1.0 nmol/μL镁离子,80 ng模板DNA,0.1 pmol/μL引物,0.15μmol/μL d NTPs,1倍扩增缓冲液;370对SSR引物对两亲本及F1进行扩增的条带显示,有差异且条带清晰的引物为87对。确立了糯玉米SSR-PCR最优反应体系,筛选并得到了87对多态性引物。     

红椿SSR-PCR体系建立和多态性引物筛选

[目的]本研究旨在建立红椿SSR-PCR最佳反应体系,并筛选适于红椿SSR分析的高多态性引物。[方法]通过L16(45)正交试验设计,确立红椿SSR-PCR最佳反应体系;利用优化后的体系对来自楝科植物的135对SSR引物,在6个不同的红椿居群中进行扩增,筛出能有效扩增的引物并进一步筛选出适于红椿的高多态性引物。[结果](1)10μL基于荧光d UTP的SSR-PCR体系中包含:10×buffer 1.0μL,Taq酶(5 U·μL-1)0.1μL,Mg Cl2(25mmol·L-1)0.8μL,d NTP(200 mmol·L-1)0.025μL,荧光d UTP(1 nmol·μL-1)0.01μL,引物(10 mmol·L-1)0.8μL,DNA模板45 ng剩余用dd H2O补足;(2)筛选出29对能有效扩增的引物,复选后获得了12对适于红椿SSR分析的高多态性引物。[结论]建立了SSR-PCR最佳反应体系并筛选出高多态性引物,为红椿的分子标记等遗传学研究提供了基础。     

冬瓜SSR-PCR体系优化及引物筛选

本研究利用L16(54)正交试验设计研究了影响冬瓜SSR-PCR的五个因子(10×Buffer(含Mg2+),d NTP,DNA,引物,r Taq),研究结果表明Buffer(含Mg2+)和r Taq对PCR影响最明显,最终筛选出最佳反应体系:10×Buffer 2.0μL(1×Buffer),d NTP 2.0μL(200μmol/μL),DNA 0.6μL(6 ng/μL),引物0.4μL(0.2μmol/L)。体系体积为20μL,循环数为35。引物筛选程序为:94℃预变性3 min,94℃变性45 s,58℃~68℃复性30 s,5个循环,每个循环退火温度降2℃,72℃延伸1 min,94℃变性30 s,50℃~58℃复性1 min,8个循环,每个循环退火温度降低1℃,72℃延伸1 min,94℃变性30 s,50℃复性30 s,72℃延伸1 min,共30个循环,72℃延伸7 min。本研究建立了适合冬瓜的SSR反应体系和引物多态性筛选程序。     

新疆野生樱桃李SSR体系的建立及应用

为建立适宜新疆野生樱桃李的SSR分子标记技术体系,通过对PCR反应程序、反应体系(DNA模板量、引物浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶用量)以及退火温度进行了探索,建立了适宜野生樱桃李的SSR-PCR反应体系。结果表明:在25μL反应体系中,Mg2+1.0 mmol/L、引物0.5μmol/L、dNTPs 0.20 mmol/L、TaqDNA聚合酶1.0 U、模板DNA 30 ng、退火温度为60℃。SSR扩增程序:94℃预变性5 min,35个循环(94℃30 s,60℃1 min,72℃1 min),72℃延伸10 min,可筛选出稳定性好、多态性高的SSR引物。     

杏SSR反应体系的优化研究

研究了杏SSR-PCR反应体系的主要成分对扩增结果的影响,并进行了体系验证.优化后的反应体系为:总体积20 μL,1×buffer、2.0 mM/L Mg2+、0.25 mM/L dNTP、0.20 μM/L Primer、60 ng/20μL模板DNA和0.05 U/μL Taq酶.利用32个杏品种验证此反应体系,6%的变性聚丙稀酰胺凝胶电泳检测结果显示,扩增产物在184～267 bp之间,不同品种间DNA谱带具有多态性, 且反应体系的稳定性和可重复性好.     

小豆SSR-PCR反应条件的优化

笔者对小豆SSR-PCR扩增体系的反应条件进行了优化,分析了Mg2+浓度、dNTP浓度、DNA模板浓度、引物浓度、Taq聚合酶浓度对PCR扩增结果的影响。结果表明:在10 μL的PCR反应体系中,Mg2+的最适浓度为2 mmol/L,dNTP最适浓度为0．25 mmool/L,反应体系中Taq聚合酶宜加入1 U,引物的最适浓度为 0．15 mmol/L,DNA模板加入量为20 ng。     

家蚕基因组中的分子标记遗传图谱

遗传标记既是基因组研究的重要内容，又是构建遗传图谱、研究生物多样性、育种、基因定位与克隆等的基因。目前，已有多项分子标记技术用于家蚕基因组的研究，并构建了多种分子标记遗传图谱，包括限制性酶切片段长度多态性（简称RFLP）、DNA随机扩增多态性（简称RAPD）、扩增片段长度多态性（简称AFLP）、简单重复序列PCR（简称SSR－PCR）等。本文就分子标记技术构建的家蚕基因组分子标记遗传图谱进行了讨论。     

基于SSR分子标记的杜仲遗传多样性体系建立

In order to set up the genetic diversity system of Eucommia ulmoides Oliver based on SSR molecular markers, the establishment of SSR-PCR reaction system and screening out SSR marker primer showing high polymorphism were studied. A L₉(3⁴) orthogonal design was performed to optimize the main factors of the SSR-PCR reaction system. The results indicated that the best SSR-PCR reaction system for E.ulmoides was DNA template 1 μL (30~60 ng·μL^-1), 2×Taq PCR Master Mix 10 μL, primer 1 μL with the total volume of 25 μL. The PCR reaction system had high stability and repeatability, the pairs of SSR primers with high polymorphism were gotten. The 8 E.ulmoides samples' DNA sequence was amplified with 13 pairs of SSR primers by SSR-PCR technique, 34 alleles were detected, 2.6 alleles were detected from per site on average. Each allele's effective number was 1.751 5, and the h value was 0.379 8, the average I value was 0.643 3. This study is helpful in using SSR molecular marker to analyze genetic diversity and genetic relationship in E. ulmoides.     

马铃薯SSR-PCR体系的优化与建立

以马铃薯叶片DNA为模板,采用单因素试验的方法,对影响马铃薯SSR-PCR反应体系的主要成分模板DNA、dNTP浓度、引物浓度、Mg2+浓度、Taq酶浓度及退火温度进行了优化,并建立最优化的马铃薯SSR扩增反应体系。结果表明:在20μL反应体系中,模板DNA用量为60 ng,dNTP为0.3125 mmol/L,引物浓度为2.4pmol,Mg2+为1.5 mmol/L,Taq酶为0.5 U,筛选各引物最适宜的退火温度,经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测,扩增条带清晰,优化后的SSR反应体系稳定性好,可用于马铃薯遗传多样性分析。     

利用PCR仪快速提取甜菜基因组DNA

为了寻找一种快速提取甜菜基因组DNA的方法,以甜菜干种子、幼苗、种仁以及甜菜叶片干粉为原料,利用PCR仪结合碱裂解法快速提取甜菜基因组DNA,利用微量分光光度计检测取DNA的浓度,并用甜菜SSR引物对提取的DNA进行扩增。结果表明,在4种材料中均检测到了DNA,干种子、幼苗、种仁以及叶片干粉中提取的DNA平均浓度分别为432、197、158、448 ng/μL,无论是DNA原液还是稀释到20 ng/μL的工作液,均能在SSR-PCR反应中扩增出清晰的条带。该方法提取甜菜基因组DNA简单、快速,仅需要Na OH和HCl两种药品,提取的DNA完全可以用于SSR-PCR反应,为快速鉴定甜菜品种纯度和真实性提供了技术支持。