广东梅州柑橘黄龙病和病毒病的发生调查及其黄龙病菌原噬菌体多样性

【目的】调查柑橘黄龙病（Huanglongbing,HLB）和病毒病在广东省梅州市柑橘主产区的危害情况,分析该地区柑橘黄龙病菌（CLas）的原噬菌体多样性。【方法】以16S rDNA为模板设计引物,利用实时荧光定量PCR（qPCR)检测梅州市不同抽检地在2017—2019年3年间柑橘黄龙病的发病情况;同时分别采用已报道的柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）、柑橘裂皮病毒（Citrus exocortis viroid,CEVd）、柑橘褪绿矮缩病毒（Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV）、柑橘碎叶病毒（Citrus tatter leaf virus,CTLV）和柑橘黄脉病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）的特异性检测引物,提取样品的RNA,反转后以样品的cDNA为模板,通过普通PCR的方法分析梅州市抽检地区柑橘病毒病的发生情况。此外,以基于2种原噬菌体类型（SC1和SC2）对应的超变异基因区域设计的2对引物（Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2）,运用普通PCR方法分析该地区CLas菌株原噬菌体的遗传多样性。【结果】除2018年9月梅州大浦顺兴公司蜜柚基地的抽检样品外,梅州市其他被检地区均发现CLas。总体来说,梅州市的脐橙CLas检出率为55.3%,蜜柚为61.5%,沙田柚为61.7%。其中2017年采集自平原县大拓镇的蜜柚和沙田柚样品CLas检出率为100%,兴宁市白马镇的蜜柚为100%,沙田柚为80%;其他抽检地区的样品CLas检出率在16.7%—83.3%。虽然梅州市部分地区的检出率较高,但其病原菌的含量并不高,大部分处于柑橘黄龙病发病初、中期,属可防可控阶段;此外,梅州市柑橘病毒的总检出率不高,CTV、CTLV和CYVCV为梅州的主要病毒,CEVd和CCDaV没有检测到。CTV、CTLV和CYVCV在脐橙上的检出率依次为78.9%、7.9%和21.1%,蜜柚为15.4%、25.0%和9.6%,沙田柚为6.4%、2.1%和4.3%。基于Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2来研究CLas原噬菌体多样性的PCR扩增条带共有4种类型（SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2）,经过PCR电泳和测序得出,来自梅州市脐橙和沙田柚的CLas菌株以SC2-1型为主,蜜柚上以SC1-1型为主。【结论】梅州柑橘产区的柑橘黄龙病目前属于可防可控阶段,其病原菌菌株的原噬菌体在不同品种上具有其独特性;由于在抽检时发现有柑橘病毒病的存在,因此在种植过程中需加强种苗监管,同时应采取有效措施对柑橘黄龙病和柑橘木虱（Diaphorina citri）进行绿色防控。     

柑橘黄龙病远红外热处理温度场分布特性试验研究

针对柑橘黄龙病热空气处理存在能耗高、加热设备笨重、传热较慢等问题,提出了柑橘黄龙病远红外热处理方法。为解决远红外加热时柑橘树温差过大的问题,搭建了柑橘黄龙病热空气快速处理温度场分布特性试验平台,研究了远红外灯管组数量、单根灯管功率、加热时间、远红外灯与支架顶部距离对柑橘树温度场分布的影响,并对远红外加热影响因素进行优化。研究结果表明:远红外灯管组数量、单根灯管功率以及加热时间对柑橘树叶和枝干的温度场分布均有显著影响,远红外灯与支架顶部距离对树叶的温度场分布影响显著。试验优化后的参数为:远红外灯管组数量为3,单根灯管功率为1 k W,加热时间为3 min,远红外灯与支架顶部距离为10 cm。在此条件下,树叶温度平均值为58. 1℃,枝干温度平均值为43. 1℃,整体温度平均值为52. 3℃。在此参数下对柑橘黄龙病进行远红外热处理田间试验,病菌浓度平均降低34. 4%。研究结果可为柑橘黄龙病规模化远红外热处理设备的优化设计提供参考。     

柑橘黄龙病菌浓度对琼中绿橙果实品质的影响

为了定量衡量黄龙病菌量对琼中绿橙果实品质的影响，本实验以采自海南琼中橘园中感染了柑橘黄龙病的琼中绿橙为实验材料，用实时荧光定量PCR相对定量的方法测定果实中柑橘黄龙病菌的浓度，同时对果实品质的8个外在指标（果实纵经、横径、果形指数、单果重、果皮率、残渣率、种子数量、种子重量）和5个内在指标（果汁率、可食率、可溶性固形物含量、可滴定酸含量、固酸比）进行测定，研究黄龙病菌浓度对琼中绿橙果实品质的影响。结果表明：随着琼中绿橙果实中柑橘黄龙病菌浓度的增大，果实外观品质变化明显的指标包括果实纵经、果形指数、单果重（p<0.05），其中果实纵经呈现明显下降趋势，从64.97mm下降到57.44mm，相对较少11.59%；果形指数呈现明显上升趋势，从0.83上升到0.94，相对增多13.25%；单果重呈现下降趋势，从166.35g下降到109.66g，相对较少34.08%；果实横径、果皮率、残渣率、种子数量、种子重量等指标变化不明显。随着琼中绿橙果实中柑橘黄龙病菌浓度的增大，果实内在品质变化明显的指标为可溶性固形物含量，可溶性固形物含量呈现明显下降趋势（P<0.05），从9.65%下降到8.19%，相对减少15.13%；果汁率、可食率、可滴定酸含量和TSS/TA没有明显变化。结论：在黄龙病菌浓度增加的情况下，琼中绿橙在果实外观、内在品质等多个指标呈现下降趋势。研究结果为定量评价黄龙病对柑橘果实的影响提供参考。     

长春花感染柑橘黄龙病菌微波热处理防控效果

为探索黄龙病防治的新途径,开展微波热处理对黄龙病的防控效果研究。该研究搭建了微波热处理平台,对长春花微波热处理参数（转盘转速、单个磁控管的微波功率、磁控管数量）进行优化,并用优化后的参数组合对感病长春花进行热处理,处理后90 d内跟踪检测长春花叶片中黄龙病菌的浓度、淀粉和类黄酮的含量。结果表明,长春花微波热处理的最优参数组合为单个磁控管的微波功率150W、3个磁控管、转速10～20 r/min;热处理90 d后,感病长春花叶片中的黄龙病菌C_t值（阈值循环数,该值低于32时为阳性）由阳性(17.01 ±0.97)转至近阴性（31.91 ±2.35）,病菌浓度下降了99.98%,淀粉含量和类黄酮含量恢复至正常水平,植株的活性恢复较好。研究表明,微波热处理有效抑制植物体内的黄龙病菌,可为黄龙病的规模化防治提供新的思路。     

Decreasing detection frequency of MITE(MCLas-A) in the population of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus' recently collected in southern China

An active miniature inverted-repeat transposable element(MITE), MCLas-A, was previously identified from ‘Candidatus Liberibacter asiaticus' known to be associated with citrus Huanglongbing(HLB, yellow shoot disease). To explore the recent transposition status of MCLas-A, 389 ‘Ca. L. asiaticus' strains collected from nine regions in China were amplified using a specific primer set and three representative ‘Ca. L. asiaticus' strains were analyzed by next-generation sequencing(NGS) approach. PCR and genomic analysis showed that the entire MCLas-A was only present in 1.80%(7/389) and the jumping-out type of the MITE was predominant(81.23%) in samples tested, suggesting high frequency transposition occurred in ‘Ca. L. asiaticus' strains recently collected from China. Biological roles of transposition of the active MITE remain to be determined.     

湖南省永州地区柑橘慢衰病与黄龙病病原鉴定及分布调查

为明确湖南省柑橘黄化症状与柑橘慢衰病和柑橘黄龙病的相关性,应用形态学和分子生物学方法对湖南省永州地区表现黄化症状的柑橘进行了两种病原的鉴定及分布调查。结果表明,造成该地区柑橘黄化现象的主要原因为柑橘半穿刺线虫和黄龙病菌对柑橘的侵染。所检样本中,柑橘慢衰病平均发生率为82.1%,土壤中的半穿刺线虫群体密度最高达到3 077条/100mL。永州地区柑橘黄龙病病菌属于韧皮部杆菌属类细菌亚洲种,平均检出率为64.3%。柑橘半穿刺线虫和黄龙病菌在柑橘园存在混合侵染现象,混合侵染率为53.6%。柑橘半穿刺线虫在永州地区柑橘产区分布广泛,是造成柑橘黄化症状的重要病因,重视并有效防控柑橘半穿刺线虫已迫在眉睫。     

柑橘胼胝质合成酶基因家族的表达分析

胼胝质由胼胝质合成酶合成,胼胝质沉积是植物对入侵病原的防御反应。为了探索胼胝质合成酶(Callose synthase,CalS)基因在柑橘中对黄龙病的应答情况,从甜橙基因组中筛选并利用生物信息学分析了柑橘胼胝质合成酶(CsCalS)家族的12个基因。这些基因编码的氨基酸序列与拟南芥中的胼胝质合成酶具有较高的同源性。荧光实时定量PCR结果显示,CsCalS5和CsCalS12在柑橘健康叶片中的表达量高于其他胼胝质合成酶基因。比较黄龙病感病材料和健康对照材料,发现CsCalS5、CsCalS7和CsCalS8在感病的‘砂糖橘’和‘强德勒’柚中均上调表达,可能参与柑橘对黄龙病病原的应答反应。     

早熟柑橘黄龙病空间格局参数特征及其应用

为了揭示柑橘早熟宫川黄龙病的空间分布信息和病株行为特征，2004-2009年采取多级抽样法于每年11月上旬在果实成熟期对2块定点样地逐株进行病级调查，取得了12组样本资料，应用聚集度指标法、Iwao 法和Taylor法等对其空间分布型进行测定检验，结果表明柑橘黄龙病在早熟宫川果园呈聚集分布，其聚集强度是随着病级升高而增加。其聚集原因经Blackith种群聚集均数测定，当m<2.1184时，其聚集是由于某些环境如气候、栽培条件、植株生育状况等所引起的；当m≥2.1184时，其聚集是由病株本身的聚集行为与环境条件综合影响所致。在此基础上提出了理论抽样数和序贯抽样模型：n=(1/D)2?[1/m+0.6761] 和Tn=1.831 /[D02-0.1581 /n]。     

柑橘黄龙病热空气快速处理温度场分布特性试验研究

针对柑橘黄龙病自然热罩热处理存在的处理周期长、效率低、对自然条件依赖大、处理罩内温差过大等不足,提出了一种柑橘黄龙病热空气快速处理方法。为解决热空气快速处理时罩内温差过大的问题,搭建了柑橘黄龙病热空气快速处理温度场分布特性试验平台,研究了有无回风道、风速、热空气入口位置、热空气出口位置、入风口热空气温度对处理罩内温度场分布的影响。试验结果表明:风速、热空气入口位置、热空气出口位置、入风口热空气温度对处理罩内各截面温度场均有显著影响(P0.05);回风道不仅能使处理罩内温度场更均匀,而且能够降低能耗。通过试验得出柑橘黄龙病快速热空气处理的优选参数为:有回风道,风速14.5 m/s,热空气入口位于处理罩下层,热空气出口位于处理罩上层,且与入口呈90?,入风口热空气温度90℃。在该优选参数下,处理罩内温度从32℃上升到48℃,耗时约为9 min,处理罩内的温度极差为3.9℃,比非优选参数下罩内的温度极差相比下降了14.1℃。并在此参数下对柑橘黄龙病进行快速热空气处理田间试验,处理后病菌浓度平均降低80.28%。研究结果为黄龙病热空气规模化处理设备的优化设计提供参考。     

柑橘黄龙病实时荧光PCR鉴定技术研究

[目的]建立一套高效、准确的柑橘黄龙病（HLB）早期鉴定手段。[方法]根据HLBsecE基因（EF164805.1）保守区域设计引物和探针,建立HLB的TaqMan探针实时荧光PCR鉴定技术。[结果]被检测的236个柑橘苗圃样品中,有54个苗圃感染了HLB,检出率为22.9%。引物特异性好。[结论]该检测方法具有快速、灵敏、重复性好等优点,其检测灵敏度达0.01 ng。