枯草杆菌重组水蛭素的冷冻干燥工艺及热稳定性研究

[目的]研究枯草杆菌重组水蛭素的冷冻干燥优化工艺及在酸碱中的热稳定性。[方法]测定不同填充剂、保护剂浓度组合下的共熔点，根据共熔点最高的原则确定其组合浓度，据此再设计水蛭素的冷冻干燥工艺。[结果]优化的冷冻干燥工艺为：填充剂浓度4％，保护剂浓度1．2％，共熔点为-30℃，装样量为3．0ml，冷冻温度-40℃，冷冻时间2h，升华干燥温度-32℃，升华时间24h，再干燥温度25℃，时间5h，活力回收为96．2％，含水量为1．48％。100℃时，酸性条件下，水蛭素非常稳定；加热结合碱性的条件下水蛭素才相当不稳定。[结论]可为进一步工业化冷冻干燥水蛭素研究提供借鉴。     

水蛭素的全基因合成及克隆

报道了水蛭素全基因的合成及克隆。根据已知水蛭素氨基酸序列及酵母菌体内蛋白质表达特性,设计了水蛭素的全基因序列,采用化学合成及酶学相结合的方法,合成了该基因片段,并逐段克隆至载体ｐＢＳ上,得到全长水蛭素基因。序列测定表明,克隆后ＤＮＡ顺序同原设计序列。     

枯草杆菌重组水蛭素的分离纯化工艺研究

［目的］优化枯草杆菌重组水蛭素的分离纯化工艺。［方法］采用系列预处理、初步层析和精细纯化试验。［结果］优化的分离纯化工艺为：发酵液经离心、三氯乙酸处理、超滤浓缩脱盐,再上阴离子交换柱,或用乙醇处理后贮存,为离子交换备用。初步层析介质用阴离子交换QSepharoseF.F.,缓冲体系为TrisHCl（pH值8.0）,体系电导率为6.0mS/cm,上样量为240.0ATU/ml介质,产品纯度为70.2％,回收率达90.0％。用SephacrylSi100凝胶过滤柱精细纯化水蛭素,在一定流速范围内,流速对纯化效果影响不大,上样量可为10.0ml,得到的纯品纯度可达95.1％,得率为93.0％,SDSPAGE电泳为单一条带。［结论］可为进一步工业化分离纯化水蛭素研究提供借鉴。     

水蛭素可利用性分析

水蛭素具有较好的药理作用,其药源丰富,在临床上应用广泛。从水蛭素药理作用、剂量及安全性、稳定性方面,对水蛭素的可利用性进行了分析,旨在为相关研究奠定基础。     

枯草杆菌重组水蛭素(HV3)的发酵工艺研究

［目的］确定芽孢杆菌发酵生产水蛭素的最佳工艺条件。［方法］以枯草芽孢杆菌为供试菌种,研究菌种活化时间、接种量、培养基装量、温度、初始pH值、碳源、氮源等对发酵的影响,在此基础上对发酵条件进行优化。［结果］最佳发酵条件为：温度37 ℃,初始pH值7,培养基装量20 ml/250 ml,菌种活化时间6 h,接种量3%,氮源为1.5%Tryptone,碳源为9.0%大豆浸出液,转速220r/min,16 h后添加0.3%Tween 80,发酵时间29 h。［结论］优化条件下,发酵液活性可达210 ATU/ml,较优化前提高13.1倍;优化条件上50 L罐放大后具有很好的重复性,发酵液活性可达208 ATU/ml。     

枯草杆菌重组水蛭素的分离纯化工艺研究（摘要）

[目的]优化枯草杆菌重组水蛭素的分离纯化工艺。[方法]通过系列预处理和初步层析和精细纯化试验。发酵液固液分离和预处理：大批的发酵液采用连续流离心,取上清液,滴加50%三氯乙酸,当pH值达到2.2～2.5时停止滴加,静置1 h,离心,取上清液,用饱和NaOH调pH值回中性。然后利用SYNDER-UF202型超滤装置进行超滤浓缩脱盐,先用孔径为0.1μm的滤膜芯进行微滤除大固粒,再用截留分子量为1 000 Da的超滤膜芯进行超滤浓缩,加蒸馏水重复超滤浓缩脱盐。然后在等电点pH 4.0左右进行6倍体积的乙醇沉淀浓缩。离子交换初步层析：最佳pH值8.0,以Tris-HCl缓冲体系为佳;强阴离子交换选用Q Sepharose F.F.介质;系统电导率6 ms/cm,水蛭素的最大上样量以每毫升介质240 ATU为佳,流速1 ml/min;优化工艺在强阴离子交换HiPrep 16/10Q上放大。Sephacryl S-100凝胶过滤柱纯化水蛭素：在一定流速范围内,流速对纯化效果影响不大,上样量可在10ml左右。[结果]优化的分离纯化路线为：大量发酵液→离心→三氯乙酸处理（91%回收率）→再离心→超滤浓缩脱盐（80%回收率）→乙醇沉淀浓缩（82%回收率）→强阴离子交换（90%回收率）→硫酸氨沉淀浓缩（90%回收率）→Sepharcyl S-100凝胶过滤（回收率93%）→纯品（总回收率=91%×80%×82%×90%×90%×93%=45%,纯度95.1%）。[结论]可为进一步工业化分离纯化水蛭素研究提供借鉴。