副溶血弧菌对南美白对虾生理生化指标的影响

在自然条件下从患红体病的养殖南美白对虾肝脏内分离出病原菌——副溶血弧菌，将该菌通过肌肉注射的方式，对南美白对虾做感染实验，以探讨副溶血弧菌对南美白对虾生理生化指标的影响。注射弧菌后南美白对虾死亡率与时间、浓度呈正相关，与半致死剂量呈负相关；虾体肌肉、肝脏组织的超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LSZ）酶活性随弧菌浓度的增加呈下降的趋势，而过氧化物酶（POD）酶活性呈上升趋势，这可能是应激反应；酯酶同工酶（EST）酶带表现出缺失，苹果酸脱氢酶同工酶（MDH）具有明显的组织特异性，并且两种酶在肌肉组织中表达最强。副溶菌弧菌感染后破坏了虾体的免疫系统，导致免疫机能的损坏，防病、抗病能力下降，进一步导致虾体患病，甚至死亡。  

应用斑点ELISA技术检测副溶血弧菌

研究了应用斑点酶联免疫吸附试验(Dot-Enzym e L inked Immunosorbent Assay,Dot-ELISA)技术检测副溶血弧菌Vibrio parahaem olyticus的方法。根据棋盘试验,确定副溶血弧菌免疫血清最佳工作浓度为1∶200,酶标抗体最佳工作浓度为1∶100,以出现明显清晰斑点者判定为阳性。用该方法检测时,副溶血弧菌呈阳性,哈维氏弧菌V.harveyi、嗜水气单胞菌Aerom onas hydrophila、河流弧菌Vf.luvialis biotype、溶藻弧菌V.alginolyticus、大肠杆菌Escherichia coli均呈阴性。斑点ELISA方法不仅具有快速、经济的特点,而且可用肉眼直接判定结果,适合在基层单位应用推广。  

蛭弧菌对草鱼免疫相关酶活性的影响

对草鱼基础饲料喷洒蛭弧菌制剂,喷洒量分别为0(对照),2 mg/g,5 mg/g,8 mg/g,10 mg/g,于第21 d,42 d分别测定草鱼血清和肝脏中免疫相关酶的活性。结果表明,AKP活性变化特点是:肝脏中AKP活性在第21 d,42 d时,实验组与对照相比,均有显著升高(P<0.05)。血清中AKP活性,第21 d时,实验组均呈现上升趋势,但与对照组相比无显著差异(P>0.05)。第42 d时,实验组与对照组相比,均有显著差异(P<0.05)。ACP活性变化特点是:血清中ACP活性,第21 d,42 d时,实验组与对照组相比,均有显著差异(P<0.05)。肝脏中ACP活性,第21 d,42 d时,实验组与对照组差异极显著(P<0.01)。SOD活性变化特点是:第21 d,42 d时,肝脏和血清中SOD活性均有小幅度升高,但是实验组与对照组相比,均无显著差异(P>0.05)。综合本次研究结果表明,饲料中添加蛭弧菌能对草鱼体内免疫相关酶系统产生积极地调理改善作用,使其非特异性免疫力得到改善与提高,结合养殖成本,建议其适宜添加量为5~8 mg/g。  

利用PCR-DGGE法分析暗纹东方鲀的弧菌菌落组成

采用16S rDNA特征序列PCR-DGGE法,分析了不同饵料饲养的暗纹东方的表皮、性腺和肠道中,以弧菌为主的细菌群落的组成。结果表明:(1)共鉴定出暗纹东方体内18种微生物,均归属于变形细菌的gamma亚群,其中13种为弧菌科细菌,3种为肠杆菌科细菌,2种为气单胞菌属细菌;(2)投喂鲜活鱼虾的与投喂人工配合饲料的暗纹东方肠道和性腺中的细菌组成是不同的,在性腺中分离到的所有12种细菌中,只有2种细菌是相同的,约占17%;在肠道中分离到的所有13种细菌中,有4种是相同的,约占31%。而在表皮上所分离到的11种细菌中,有7种细菌是相同的,约占64%;(3)DGGE特征条带V1、V13、V18、V14和V17所代表的细菌只在表皮组织被分离到,V6所代表的细菌仅出现在以鲜活鱼虾作为饵料的暗纹东方性腺中,V5所代表的细菌仅出现在以鲜活鱼虾作为饵料的暗纹东方肠道中;(4)DGGE特征条带V5、V8、V13、V18、V6、V14和V17所代表的细菌不能在TCBS培养基上培养,占18种被鉴定的细菌总数的39%。  

感染鳗弧菌对花鲈非特异性免疫功能的影响

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是海水鱼常见的一种细菌性病。以A 组：1*10⁶ cfu/mL、B组：1*10⁷ cfu/mL、C组：1*10⁸ cfu/mL 3组不同浓度的鳗弧菌菌液通过腹腔注射感染花鲈（Lateolabrax japonicus），在其感染后不同时间取血，通过测定呼吸爆发、碱性磷酸酶（ALP）、酸性磷酸酶(ACP)、酚氧化酶(PO)以及超氧化物歧化酶(SOD)活力的变化趋势来研究感染鳗弧菌对花鲈的非特异性免疫功能的影响。结果表明：呼吸爆发在鳗弧菌感染12 h、36 h时，B组和C组与对照组比较极显著下降(P<0.01)；PO活性，在鳗弧菌感染12 h、36 h、60 h、84 h、108 h时，A组、B组、C组与对照组比较差异极显著下降(P<0.01)；ALP活性，在鳗弧菌感染60 h时，A组、B组、C组与对照组比较差异极显著下降(P<0.01)；ACP活性，在60 h、84 h、108 h时，A组、B组、C组与对照组比较差异显著升高(P<0.05)；SOD活性，在鳗弧菌感染12 h、36 h、60 h、84 h、108 h时，无显著性差异(P>0.05)。此外，在半致死的实验中，鳗弧菌浓度为1*10⁶ cfu/mL、1*10⁷ cfu/mL 、1*10⁸ cfu/mL的实验组的50%的致死时间分别为12 d、11 d、8 d，对照组则无死亡。结果表明:在感染期间，实验组鱼表现出特定的症状，如尾鳍溃烂、鳃丝发白、内部有黄色粘稠腹水等;鳗弧菌浓度越高，达到50%的致死时间越早,花鲈的死亡率和鳗弧菌的浓度成正相关。  

EMA结合PCR技术有效鉴别副溶血弧菌死活细胞

将EMA(Ethidium monoazide)选择渗透性和PCR技术相结合,建立检验副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus死活细胞的EMA-PCR新方法.研究表明,25μg/mL或更高质量浓度的EMA可以抑制2.0×107 CFU/mL的副溶血弧菌死细胞DNA的扩增,未经EMA处理的对应样品PCR反应呈阳性;而用相同浓度EMA处理2.0×107 CFU/mL的活细胞菌悬液能扩增出目的产物.同时,对EMA处理中卤素灯的曝光时间进行优化,确定EMA处理的最佳曝光时间为5～10 min.结果证明,该方法是一种快速有效的检测死活细胞的新方法,能有效避免PCR检测假阳性结果的出现.  

多重PCR检测四种食源性病原弧菌

【目的】建立在扩增内标存在下同时快速检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌4种食源性致病菌的五重PCR方法。【方法】以细菌16S rRNA基因为扩增内标靶序列，针对溶藻弧菌gyrB基因、副溶血弧菌collagenase基因、创伤弧菌vvhA基因、霍乱弧菌ompW基因，分别设计特异性引物，建立多重PCR体系，对其灵敏度和特异性进行评价，并将建立的五重PCR应用于弧菌的筛选。【结果】建立的多重PCR检测体系对混合模板中副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌的灵敏度达10 CFU/mL，霍乱弧菌的灵敏度达105 CFU/mL，经特异性评价证实其特异性好，并能有效指示PCR反应的假阴性，将建立的多重PCR应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定，其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够快速、灵敏、准确地检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌4种食源性致病菌，灵敏度高，并能有效指示PCR反应的假阴性，适用于食品中常见致病性弧菌的快速筛检。  

废弃农药厂污染场地浅层地下水生态毒性诊断研究

选择大型溞、斜生栅藻、发光菌为试验生物,对某废弃农药厂污染场地4个不同区域土壤剖面浅层地下水编号为CP01、CP02、CP03、CP04的4种水样进行了急性毒性试验,同时对水样进行了化学分析。结果表明,4种水样对大型溞的24h-EC50分别为0.29%、5.12%、0.83%、1.99%;对斜生栅藻的96h-EC50分别为11.04%、50.44%、12.21%、41.66%;对费舍尔弧菌的发光抑制率分别为95%、66%、88%、75%。化学检测结果表明,CP01中的主要污染物为苯系物与少量烷烃、烯烃类多种物质,CP02中的污染物质只有少量二氯甲烷与1,2-二氯乙烷两种物质,CP03、CP04中的主要污染物为苯系物与烷烃多种物质。毒性试验结果与化学检测结果具有较好的相关性,3种试验生物的毒性效应结果相一致。该研究方法简单快速,可以用于污染场地水样污染毒性诊断,快速筛选出敏感区域,同时提供污染物质的联合毒性基础数据,为场地进一步危害识别与风险评估提供依据。  

抗副溶血弧菌IgY的提纯及检测副溶血弧菌的间接ELISA的建立

分离纯化抗副溶血弧菌IgY,并建立一种快速检测副溶血弧菌的间接酶联免疫吸附法(indirect ELISA),分析了该方法的敏感性、特异性和重复性. 将水稀释法、乙醇沉淀法和DEAE-Sepharose FF离子交换层析联用以分离纯化抗副溶血弧菌IgY,然后以纯化的IgY为一抗,辣根过氧化物酶标兔抗鸡IgY为二抗,建立检测副溶血弧菌的间接ELISA方法. 结果表明:建立的间接ELISA方法,一抗的最佳工作质量浓度为15 μg/mL,二抗的最佳稀释度为1∶ 10 000,副溶血弧菌培养液的检出限为1.0×105 cfu/mL,该方法对测定的其他8种菌株没有交叉反应. 建立的间接ELISA方法具有良好的灵敏度、特异性和稳定性,能够快速、准确地对副溶血弧菌进行检测.  

创伤弧菌FJ03-X2胞外产物对欧洲鳗鲡的致病性和免疫原性分析

以70%饱和硫酸铵盐析法制备鳗源创伤弧菌生物1型高致病菌株FJ03-X2的胞外产物(ECPs),攻毒试验表明,该ECPs对鳗鲡无致病力;SDS-PAGE分析表明,该ECPs由约36 ku为主的系列蛋白条带组成。制备ECPs的免疫刺激复合物(ISCOMs),以20μg/尾的剂量腹腔注射免疫规格为15~20 g/尾的欧洲鳗鲡,ELISA分析表明,21 d和28 d时的血清抗体效价约为1∶1 280,免疫印记显示,ECPs中分子量为36 ku以上的蛋白成份可被免疫欧洲鳗鲡血清所识别,是构成ECPs的主要免疫原;免疫保护试验表明,免疫欧洲鳗鲡显示出较高的免疫保护力。试验结果也显示出,单纯以ECPs等剂量腹腔注射免疫欧洲鳗鲡,不能激发欧洲鳗鲡产生较高滴度的血清抗体,免疫欧洲鳗鲡也未能产生有效的保护性免疫应答。