长距离PCR法扩增RHDV全基因组及其序列分析

从人工感染RHDV致死的兔肝组织中提取病毒总RNA,应用特异性引物将病毒RNA反转录成cD-NA,以此为模板用长距离PCR法扩增RHDV全基因组,将成功扩增出的RHDV全基因组克隆到pMD18-T载体中,经PCR鉴定及酶切分析后进行序列测定。测序结果表明,JX97全基因组由7 437个核苷酸组成,包括由9个核苷酸组成5′NCR、59个核苷酸组成3′NCR和一个至少含有27个核苷酸的poly(A)尾。序列比较结果显示,RHDVJX97株的衣壳蛋白与已报道的参考毒株具有较高的序列同源性,均在90%以上,提示所有的RHDV分离株具有较近的亲缘关系。     

兔病毒性出血症病毒的提纯及部分特性鉴定

应用建立的SDS—蔗糖密度梯度超速离心法,纯化了从兔肝组织中粗提的兔病毒性出血症病毒。通过血凝、电镜观察、SDS-PAGE、琼脂双向免疫扩散、免疫印迹等试验,证明SDS—蔗糖梯度柱分离的病毒纯度高,具有4种结构多肽。     

RABBIT HEMORRHAGIC DISEASE VIRUSES DETECTED IN PET RABBITS IN A COMMERCIAL LABORATORY IN EUROPE

Rabbit hemorrhagic disease (RHD) is an important cause of disease and mortality in wild and domestic European rabbits (Oryctolagus cuniculus) throughout the world. Testing for 2 distinct RHD virus types (RHDV/RHDVa and RHDV2) was carried out on samples collected from 684 rabbits submitted from veterinary practices and private owners throughout Europe between January 2015 and June 2017. Four (0.6%) were positive for RHDV/RHDVa and 257 (37.4%) were positive for RHDV2. RHDV/RHDVa was detected in individual samples from Germany and the Netherlands, while RHDV2 was found in animals from Germany, Great Britain, Luxembourg, The Netherlands, Spain, Switzerland, Poland, Belgium, Austria, Sweden, and Finland.     

一种新的动物传染病——马麝病毒性出血症

马麝（Moschus chrysogaster, Alpine Musk Deer）是中国特有的一种麝属动物资源,属于世界自然保护联盟（IUCN）“濒危”级野生动物。其主要分布于青藏高原及周边区域,包括青海、宁夏贺兰山、甘肃祁连山及肃南山地、四川西部地区、云南北部高山地区及西藏东南部,其中以甘肃兴隆山马麝种群密度较大。20世纪90年代初,兴隆山国家自然保护区建立了中国第一个马麝人工驯养基地。但随着基地养殖规模的扩大及马麝种群生活方式的改变,疾病亦开始侵扰圈养马麝种群,并逐步成为制约其进一步发展的重要因素。统计资料表明,在1998-2005年因病死亡的马麝中,呼吸系统疾病占26.8%、运动系统疾病占16.5%、消化系统及营养性疾病占14.6%、心血管系统疾病占13.0%。在马麝种群内发生严重传染性疾病流行的案例并不多见。 2008年以来,兴隆山自然保护区内人工圈养马麝种群中开始流行一种以马麝心、肝、脾、肺、肾、小肠、脑等组织和器官的充血、出血和坏死为主要特征的急性、高度致死性传染病。该病以1岁内的马麝多发,以6月龄左右幼麝最为易感且致死率极高。绝大多数病例无症状急性死亡,个别病程稍长者,表现精神沉郁、采食和饮水停止且死前有角弓反张等神经症状。多年来,该病给兴隆山马麝养殖产业造成了重大的经济损失,但其真正的病原始终未能确定,以致难以对该病进行有效的预防和控制。甘肃农业大学研究团队采集病死马麝的心、肝、脾、肺、肾等内脏器官,匀浆并反复冻融后离心,取上清经过滤除菌后接种鸡胚、羊睾丸原代细胞、兔肾原代细胞、兔肺原代细胞、MDBK细胞、Hela细胞、Vero细胞、MDCK细胞等不同动物源性细胞和绵羊、山羊、家兔、鸡、鸽、小鼠等不同实验动物,对该病病原进行分离,并结合电镜观察、血清学试验和核酸序列分析对该病病原进行鉴定。电镜观察结果显示,该病病原为一种杯状病毒,其病毒粒子呈球形、直径约35 nm,20面体对称,无囊膜,表面有短的纤突。该病毒暂被定名为马麝出血症病毒（Moschus chrysogaster hemorrhagic disease virus, McHDV）。基因组测序结果证实,McHDV基因组全长为7 437 bp,其核酸序列与GenBank中兔出血症病毒（RHDV）的基因组核酸序列同源性高达89.2%-98.7%,且McHDV基因组结构与国内外经典RHDV的基因组结构相同,5'-端非编码区为1-9 bp,有两个编码区分别为ORF1（10-7 041 bp）,ORF2（7 025-7 378 bp）,3'-端非编码区为7 379-7 437 bp。鸡胚感染试验结果表明,McHDV对鸡胚的发育无不良影响,亦不能在鸡胚上增殖。不同细胞感染试验结果显示,该病毒在所有试验细胞中均不能有效增殖。动物感染试验表明,在所有受试实验动物中,唯有家兔对其易感且致死率极高,而且病死兔肝、肺等内脏器官中有大量的病毒粒子。因此,可用家兔进行该病毒的扩增培养和传代。研究者认为,该病为杯状病毒科的兔出血症病毒疑似毒株感染马麝所致的马麝病毒性出血症（Moschus chrysogaster viral hemorrhagic disease, McVHD）。此研究是兔出血症病毒对其他动物致病的首个实证案例,为该病的诊断和防控奠定了重要基础。     

A simple and rapid method for isolation of caliciviruses from liver of infected rabbits

Rabbit Haemorrhagic Disease Virus (RHDV), a member of the Caliciviridae family, is the etiologic agent of Rabbit Haemorrhagic Disease (RHD); this viral disease is highly contagious and kills more than 90% of infected adult rabbits. Research on experimental calicivirus infection uses inocula obtained from livers of rabbits dying from calicivirus infection. This implies that caliciviruses have to be purified from liver homogenates. Current methods to isolate caliciviruses from rabbit livers are time consuming. We propose here a new procedure for fast purification of rabbit caliciviruses from liver homogenates that uses centrifugation through an iodixanol gradient. This method offers in approximately 2 h a sample with a high degree of calicivirus purity, as shown by its biochemical and immunocytochemistry analysis, which is also able to kill adult rabbits from RHD within 48 h of inoculation.     

猪瘟活疫苗(脾淋源)污染外源性兔出血症病毒的检测与启示

在进行2批猪瘟活疫苗（脾淋源）效力检验时,出现效力检验家兔突然死亡现象,为了查明家兔死亡原因,采用无菌检验、支原体检验、血凝试验、兔体中和试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）对疫苗或注苗后死亡家兔肝脏、脾脏混合病料进行了检测。结果显示,疫苗的无菌检验、支原体检验结果均为阴性;疫苗及注射疫苗死亡家兔肝脏、脾脏混合病料具有较低的血凝价,血凝试验结果均为可疑;在兔体中和试验中,中和组家兔2／2健康存活,未中和的疫苗对照组家兔2／2死亡;疫苗及注射疫苗死亡后家兔肝脏、脾脏混合病料的ELISA检测结果均为阳性。检测结果证实疫苗中含有兔出血症病毒（Rabbit Haemorrhagic Disease Virus,RHDV）。猪瘟活疫苗（脾淋源）污染RHDV的现象启示：应该加强猪瘟活疫苗（脾淋源）抗原制备过程的控制;同时有必要对猪瘟活疫苗（脾淋源）质量标准进行修订使之进一步补充完善。     

兔出血症病毒VP60主要抗原表位基因的克隆与序列分析

本实验用RHDV CD株人工感染家兔,发病死亡后,取肝脏匀浆,用Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒RNA。根据Genbank已发表序列保守区设计并合成引物,采用RT—PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。PCR产物纯化后,进行序列测定。测序结果表明,VP60主要抗原表位基因长525bp。该序列与已发表的其它13株RHDV VP60同一核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性比较。结果显示,CD株核酸序列与WX-84株同源性最高为97.5%,与其它毒株的同源性在92.0%~96.6%之间。氨基酸序列与WX-84株、墨西哥Mexico-89株同源性最高为99.4%,与其它毒株的同源性在96.6%~98.3%之间。     

An outbreak of rabbit hemorrhagic disease (RHD) caused by Lagovirus europaeus GI.2/rabbit hemorrhagic disease virus 2 (RHDV2) in Ehime, Japan

A total of ten 1–2-year-old rabbits died within 2 weeks at a facility in Ehime prefecture in May 2019. Necropsy revealed liver discoloration and fragility, hemorrhage of some organs and blood coagulation failure. On histopathologic examination, necrotizing hepatitis was a common finding, together with fibrin thrombi in the small vessels and hemorrhage in some organs. Rabbit hemorrhagic disease (RHD) virus gene was detected in liver samples, and viral particles of approximately 32 nm in diameter were found in the cytoplasm of degenerated hepatocytes by electron microscopy. Phylogenetic analysis based on the partial VP60 gene sequence classified it as Lagovirus europaeus GI.2/RHDV2. This is the first confirmed outbreak of RHD caused by globally emerging GI.2/RHDV2 in Japan.     

西藏兔病毒性出血症的研究--病原鉴定及疫苗免疫效力试验

１９９４年６￣７月,西藏林芝地区家兔大批急性死亡同,经过流行病学调查,临诊断症状观察,病理剖检等结果与兔病毒性出血症特征相符。进一步作病毒学检查表明,病变组织超薄发切片经电子显微镜观察发现有大量直径约３０ｎｍ的球状裸听病毒粒子,自然病死兔肝组织匀交涉 清能凝集入）型红细胞,而且血凝兔出血症病毒阳性抗血清所抑制,致病性试验结果表明,该病毒对兔有很强的致病性;用西藏自然病死兔肝组织匀浆试制的矩形疫苗兔