在板栗疫病菌线粒体中检出低毒病毒编码蛋白p29

p29蛋白是低毒病毒基因组编码的一个木瓜蛋白酶样蛋白。前人研究发现,在宿主板栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）体内表达p29,会引起真菌毒力降低,色素产生减少,丧失产生无性孢子的能力。除已知p29与源于高尔基体的膜结构共分离之外,p29在细胞内的其它分布形式未明。本研究在成功制备p29特异抗体和高效分离板栗疫病菌线粒体的基础上,尝试用p29抗体检测线粒体中是否存在p29蛋白。Western印迹结果表明,受CHV1-EP713感染的EP713菌株线粒体中存在与p29抗体特异作用的病毒蛋白。本研究结果暗示,低毒病毒蛋白p29可能参与调控宿主线粒体功能。     

低毒病毒及板栗疫病菌低毒力机制

低毒病毒是一类存在于板栗疫病菌细胞质中自主复制的无衣壳正链RNA病毒。感染低毒病毒后,板栗疫病菌的致病力显著降低,色素分泌减少,菌丝体由感染病毒前的桔黄色变为白色,产孢量降低或不产孢,漆酶表达水平明显下降。低毒病毒侵染性克隆的获得以及高效转化和转染体系的建立,使得低毒病毒成为目前唯一可以进行全面遗传操作的真菌病毒。利用低毒病毒作为探针来探测板栗疫病菌的致病力组成和毒力调节机制,己获得了一些很有意义的发现。本文介绍近几年低毒病毒及其与真菌相互作用的研究进展,包括低毒病毒的基因组和功能基因研究、低毒病毒和线粒体损害引起的板栗疫病菌低毒力机制、板栗疫病菌的RNA沉默系统以及低毒病毒抗RNA沉默的机制。低毒病毒／板栗疫病菌系统已经成为研究病毒与宿主相互作用以及病原真菌致病机理的很好的模式系统。     

应用二维液相色谱评价低毒病毒感染对板栗疫病菌总蛋白表达的影响

根据丝状真菌自身的特点,本文建立了一套完整的适合于板栗疫病菌蛋白质组分析的总蛋白质提取方法,并使用二维液相系统对野生强毒株EP155和受低毒病毒感染的弱毒株EP713进行了差异蛋白质组的比较。用ProteoVue和DeltaVue软件进行分析,得到了重复性较好的二维模拟凝胶图谱,在EP155和EP713之间共找到296个峰值差异强度在2倍以上的蛋白质紫外吸收峰：以EP155为标准,病毒感染导致蛋白上调的209个,下调的87个。根据蛋白质分子量,使用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳可以得到纯度更高的蛋白质条带,本研究为大规模质谱鉴定丝状真菌差异表达蛋白质提供了一种新方法。     

低毒病毒-板栗疫病菌系统作为抗正链RNA病毒化合物筛选模型的研究

板栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）是引起板栗疫病的病原真菌。低毒病毒是一类侵染板栗疫病菌的无衣壳正链RNA病毒。无病毒栗疫病菌野生型菌株在PDA培养基上形成桔黄色菌落,而带毒株在则形成白色菌落。本研究利用已知的不同机制的抗病毒药物处理无病毒和感染病毒的板栗疫病菌菌株,观察菌丝体颜色变化并检测菌丝体中病毒双链RNA（dsRNA）的含量。结果显示,抗病毒药物处理后,带毒株系EP721和Euro7的菌丝体颜色表型发生明显变化,且病毒dsRNA累积量与菌丝体颜色变化存在明显相关性：随着药物浓度增大,菌丝体颜色加深,病毒dsRNA积累量下降。因此,可以根据菌株颜色的变化判断药物对病毒复制或症状表现是否有效,从而极大简化抗RNA病毒药物的初步筛选过程。     

大规模板栗疫病菌cDNA文库的特征和冗余序列的排除

低毒病毒/板栗疫病菌是一个研究病毒宿主相互作用的优良的实验系统.为了更好的了解病毒与宿主相互作用的机制,我们建立了一个野生型无病毒板栗疫病菌菌株EP155和受低毒病毒感染的菌株EP713的cDNA混和文库,以进行表达序列标签（EST）测定.对543个克隆的外源片段的分析表明,该文库克隆中含外源片段的比例为89.8%;通过小规模测序,发现空质粒与小片段克隆占测序总数的10.1%;表达丰度最高的4个克隆出现次数的总和占测序总数的9.6%.通过设计引物进行PCR和原位杂交,对cDNA文库2万多个克隆进行了筛选,共筛除了占总数19.7%的空质粒与小克隆和5.5%的高丰度克隆,为高效率的大规模EST测序准备了条件.     

Characterization of mutants of the chestnut blight fungus (<Emphasis Type="Italic">Cryphonectria parasitica</Emphasis>) with unusual hypovirus symptoms

The type virus of the family Hypoviridae, Cryphonectria hypovirus 1 strain EP713 (CHV1-EP713), infects Cryphonectria parasitica, the filamentous causal fungus of chestnut blight, and reduces its virulence. This pathosystem serves as a model to study fungus-mycovirus interactions. We previously developed a genetic screening protocol for host factors associated with symptom induction by CHV1-EP713 and its mutants. In the procedure the standard field fungal isolate EP155 was transformed by cDNA from a mild hypovirus mutant Cys(72), launching virus infection, and mutagenized by random plasmid insertion with pHygR conferring hygromycin resistance. We now report an extension of the study to characterize different mutant strains, with different phenotypes than their parental strain TCys(72)-1. TCys(72)-1 is moderately reduced in pigmentation and sporulation compared to the uninfected wild-type strain EP155. Mutants sfb1, sfb2 and k202 were characterized biologically and molecularly in comparison to the previously isolated mutant (namA) and the parental strain. These mutants harbored one (sfb1) or more copies (sfb2 and k202) of the mutagenic plasmid, pHygR. The three mutants had similar biological attributes; that is, vegetative growth rate, conidiation and virulence (assay on apples) was reduced on potato dextrose agar media, relative to the parental strain and pigmentation was the same or slightly increased. Interestingly, viral dsRNA accumulation levels were apparently unaltered in these mutants. The screening method was efficient for mining fungal mutants with unusual hypovirus symptoms. Further, characterization of the mutants provides interesting insights into symptom induction by the hypovirus.