马铃薯StNF-Y核转录因子基因的克隆和生物信息学分析

为了研究马铃薯StNF-Y基因在非生物逆境中的作用与功能,在马铃薯抗青枯病基因型ED13中克隆了1个新的NF-YC转录因子(StNF-Y),并对其进行生物信息学分析,预测其生物学功能。结果表明,StNF-Y基因的全长cDNA为1 132 bp,其开放阅读框为693 bp,编码230个氨基酸,氨基酸分子式为C_(1112)H_(1735)N_(317)O_(339)S_(10),等电点为5.37,含有13个磷酸化位点;StNF-Y蛋白分布在胞质中,无信号肽,属于亲水性蛋白,含有高度保守的结构域,属于BUR6 superfamily家族;二级结构显示,StNF-Y蛋白主要由45.65%的α-螺旋、5.65%的延伸链、45.22%的无规则卷曲和3.48%的β-转角组成。系统进化分析结果显示,马铃薯StNF-Y序列与番茄、辣椒和烟草NF-YC序列亲缘关系较近。此外,StNF-Y在多种植物胁迫中起作用。因此,推测StNF-Y可能参与马铃薯相关胁迫抗性的调节。研究结果可为以后进一步深入研究马铃薯StNF-Y的功能以及对逆境胁迫的抵抗机制提供理论依据。     

马铃薯StUOXs基因家族的生物信息学分析

马铃薯(Solanum tuberosum)是世界第三大粮食作物,其产量和品质受到生物与非生物胁迫的影响。泛醌氧化酶(ubiquinol oxidase,UOX)是一种由核基因编码的线粒体末端氧化酶,在植物生长发育及胁迫应答中发挥重要作用。为了解StUOXs在马铃薯抗病过程中发挥的应答反应,利用生物信息学方法在马铃薯基因组中鉴定出5个StUOXs基因,对其理化性质、染色体定位、三级结构、进化关系、保守结构域、启动子元件和表达谱尤其是受青枯菌(Ralstonia solanacearum)诱导的表达模式进行了分析。结果表明:马铃薯StUOXs基因编码的氨基酸数在279~366,相对分子质量为31~42 ku,亚细胞定位在线粒体中;系统进化分析发现,马铃薯StUOXs成员与番茄、辣椒的UOXs成员的亲缘关系最近,较之拟南芥、烟草亲缘关系稍远;FPKM数据分析发现,StUOXs主要受盐、激素和生物胁迫诱导而在叶片中表达,这与其启动子中的存在的激素应答等顺式作用元件相对应。青枯菌接种后的qRT-PCR实验表明,StUOX4参与马铃薯青枯病的早期应答反应。     

二倍体马铃薯群体青枯病抗性鉴定及遗传分析

将含有青枯病抗性基因的马铃薯二倍体solanumphureja和s.vernei的原始材料E与另外两种材料C、D杂交获得F1和BC1两个群体。对其中140个基因型做温室苗期人工接种鉴定，结果表明，马铃薯青枯病的群体抗性分离变异范围较大，抗病性表现复杂，主要表现为阻止病菌入侵，推迟始发病时间，延长潜伏期，减缓发病速度和降低死亡率等5个方面。对抗病性相关参数分析表明，马铃薯青枯病抗性是受隐性多基因控制的。     

马铃薯非特异性脂质转移蛋白基因StLTPa1的克隆和表达

非特异性脂质转移蛋白(nsLTP)是植物中大量存在的小分子脂类结合蛋白, 具有多种生物学功能, 如抗菌防御、信号传导、胞壁松弛、蛋白酶抑制等。通过接种青枯菌(Ralstonia solanacearum), 从马铃薯栽培品种中薯3号中获得一个新的非特异性脂质转移蛋白cDNA克隆StLTPa1, 序列分析表明该基因含636 bp核苷酸, 编码91个氨基酸, 属于I类非特异性脂质转移蛋白。基于氨基酸序列构建的系统发生树揭示, 该基因与其他茄科nsLTP具有高度保守的序列相似性, 核酸和氨基酸水平分别具75%~85%和60%~92%的同源性。对该基因在互作早期基因表达时空性分析表明, StLTPa1基因不仅受病菌的诱导, 在不同抗、感病的马铃薯基因型中差异表达, 而且受一定浓度外源非生物激发子如水杨酸、茉莉酸和脱落酸的诱导并产生一定时间的持续效应, 其诱导表达模式也表现出一定的差异。原位杂交结果显示StLTPa1主要在马铃薯茎、叶维管束系统的韧皮部细胞中表达。这些结果说明StLTPa1基因受病菌和非生物激发子诱导, 在植物防御反应中发挥作用。     

马铃薯再生体系的建立及其遗传分析

以马铃薯品种中薯2号为试材,筛选不同的培养条件建立了较高效的马铃薯再生体系,并对其再生过程进行了蛋白质检测和RAPD分析。愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+6-BA2.25mg.mL-1+NAA0.1￣0.2mg.mL-1,愈伤组织的诱导率达到73.17%～76.01%。自然生长、初代培养和继代培养的马铃薯再生体的水溶性蛋白之间存在着一些差异。利用RAPD标记技术,通过对54个引物的严格筛选,获得了3个扩增产物略有差异的引物。     

马铃薯非特异性脂质转移蛋白基因StLTPa1的克隆和表达

非特异性脂质转移蛋白（nsLTP）是植物中大量存在的小分子脂类结合蛋白,具有多种生物学功能,如抗菌防御、信号传导、胞壁松弛、蛋白酶抑制等。通过接种青枯菌（Ralstonia solanacearum）,从马铃薯栽培品种中薯3号中获得一个新的非特异性脂质转移蛋白cDNA克隆StLTPa1,序列分析表明该基因含636bp核苷酸,编码91个氨基酸,属于I类非特异性脂质转移蛋白。基于氨基酸序列构建的系统发生树揭示,该基因与其他茄科nsLTP具有高度保守的序列相似性,核酸和氨基酸水平分别具75%～85%和60%～92%的同源性。对该基因在互作早期基因表达时空性分析表明,StLTPa1基因不仅受病菌的诱导,在不同抗、感病的马铃薯基因型中差异表达,而且受一定浓度外源非生物激发子如水杨酸、茉莉酸和脱落酸的诱导并产生一定时间的持续效应,其诱导表达模式也表现出一定的差异。原位杂交结果显示StLTPa1主要在马铃薯茎、叶维管束系统的韧皮部细胞中表达。这些结果说明StLTPa1基因受病菌和非生物激发子诱导,在植物防御反应中发挥作用。     

青枯菌M5菌株特异基因组消减文库的构建

为筛选青枯菌M5菌株特有的序列,利用SSH技术对青枯菌生理小种5号菌株M5（tester）和生理小种1号菌株GMI1000（driver）基因组进行了比较。分别提取二者基因组DNA,RsaⅠ酶切,将酶切后M5菌株DNA分为两份,分别与接头1和接头2R连接,然后进行两轮杂交和两轮PCR扩增,并检测连接效率与消减效率。将获得的消减PCR产物,即差异基因/差异DNA片段,与pGEM-T载体连接,转化E.coli DH5α感受态细胞,建立消减文库。随机挑取96个白色克隆,经菌液PCR法测定,80个为预期阳性,含有预期的插入片段。首次构建了青枯菌M5菌株特异基因的抑制消减文库,为进一步筛选、克隆青枯菌M5菌株特异核苷酸片段奠定了基础。     

高温胁迫对马铃薯幼苗叶片生理效应的影响

以中薯3号为材料,研究了高温胁迫对马铃薯幼苗叶片膜脂过氧化、体内保护系统以及叶绿素含量等生理效应的影响。结果表明,在高温胁迫下,叶片中叶绿素和抗坏血酸含量下降,超氧阴离子自由基(O2-)、丙二醛(MDA)含量、脯氨酸含量上升;超氧化物歧化酶(SOD)活性呈现出先升后降的变化趋势,而多酚氧化酶(PPO)活性却一直呈上升趋势。说明高温逆境降低了植物体防御活性氧有关的酶促和非酶促保护系统的能力,提高了体内自由基浓度,加剧了膜脂过氧化。由此认为高温胁迫下马铃薯幼苗体内抗氧化酶活性受到抑制,活性氧积累以及由此引起的膜脂过氧化是马铃薯幼苗高温伤害的原因之一。     

感染青枯病马铃薯中几种酶及蛋白质含量变化的研究

[目的]揭示感染青枯茵马铃薯抗病机制,推动和指导抗感染青枯茵马铃薯品种的选育.(方法)给同一品种的马铃薯接种青枯菌后测定其几种酶的活性及蛋白质含量.[结果]接种后苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性均比对照高,其中第3天变化幅度较大,约比对照升高4.67倍.接种后PAL的活性变化分剐在3天、7天出现2次高峰.过氧化物酶(POD)活性在接种后第5天达高峰,约高于对照3.62倍.多酚氧化酶(PPO)活性在接种后第5天这高峰,第7天达最小值.马铃薯感染青枯病后蛋白质含量呈下降趋势.[结论]3种酶活性变化出现的峰值强弱可作为早期鉴定感染青枯茵马铃薯的一种有价值的生理指标.