武夷菌素高产基因工程菌发酵培养基的优化

为进一步提高武夷菌素的产量,以基因工程菌Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis W273为试验菌株,采用单因子试验确定发酵培养基的最适6种营养成分为玉米粉、葡萄糖、黄豆面、氯化铵、碳酸钙和氯化镁;应用SAS软件中的Plackett-Burman设计法,对影响菌株发酵生产武夷菌素的6个因素进行了筛选,确定葡萄糖和碳酸钙为影响摇瓶发酵生产武夷菌素的主要因素。利用响应面分析法对2个主要因素的最佳水平及其交互作用进行研究,建立了二次回归方程,Y=218.18+270.28X₁+1274.74X₂-3.28X₁²-5.4X₁X₂-200.98X₂²,并最终确定最佳培养基配方为玉米粉20 g/L、葡萄糖39 g/L、黄豆面20 g/L、氯化铵4 g/L、碳酸钙2.65 g/L、氯化镁0.4 g/L。以新配方在28℃、220 r/min进行摇瓶发酵60 h后,武夷菌素效价平均值为7215 μg/mL,较原始培养基发酵后武夷菌素效价提高了26.5%。     

武夷菌素部分生物合成基因簇的克隆和分析

不吸水链霉菌武夷变种Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis CK-15是从福建省武夷山土样中分离得到的一株链霉菌,其代谢产物武夷菌素对果蔬真菌病害具有良好的防治效果,但是因其产量低的缺点限制了武夷菌素工业化生产和农业生产中的应用。为了实现利用基因工程培育高产新菌株的目标,首先要获得武夷菌素的生物合成基因。根据大环内酯类抗生素聚酮合成酶基因设计引物筛选菌株CK-15的基因组文库,共获得9个阳性克隆。克隆和测序获得3个较长scaffold片段,序列总长度达53.291 kb,其中包含了14个可能阅读框,通过同源比对证实该序列与S.noursei ATCC 11455的制霉素生物合成基因有很高的同源性。本研究为进一步研究武夷菌素生物合成基因的功能,并通过基因工程培育高产新菌株奠定了基础。     

细叶百合组织培养植株再生

以细叶百合的鳞片和花丝为外植体,通过两种不同的发生方式,成功获得再生植株,并建立了细叶百合两种外植体的再生体系。结果表明:鳞片可以通过器官直接发生途径再生,其最适诱导培养基为MS+NAA0.5mg·L-1+6-BA1.5mg·L-1;花丝通过愈伤组织间接器官发生途径再生,诱导愈伤组织的最适培养基为MS+2,4-D2mg·L-1+KT2mg·L-1,诱导愈伤组织产生不定芽的最适培养基为MS+NAA0.5mg·L-1+6-BA2.0mg·L-1;最适继代增殖培养基均为MS+NAA0.2mg·L-1+6-BA1.0mg·L-1;最适生根培养基为1/2MS+IBA0.5mg·L-1。     

一株烟草肠杆菌（Enterobacter tabaci）S4菌株的鉴定及其效果测定

为筛选出一株具有微生物源植物调节剂功能的细菌，并探讨其潜在的生物功能，利用平板涂布法以及16S rRNA鉴定技术对菌株进行分离、鉴定；同时使用该菌株发酵液对番茄的种子和幼苗分别进行浸种和灌根处理，并进行农艺指标测定。结果表明：经鉴定该菌株为烟草肠杆菌，其发酵液对番茄种子的萌发、幼苗的生长具有显著的促进作用；发酵液浓度为1×10⁴ cfu·mL^-1时促生效果最好，与对照相比，根长、株高、干质量和鲜质量分别增加63.42%、46.17%、150.00%和144.83%。研究结果可为该菌株开发为微生物肥料或微生物源植物生长调节剂提供技术支持。     

产气克雷伯氏杆菌 Klebsiella aerogenes S2对植物病原真菌的抑菌活性及番茄促生效果

本研究以广西红树林的根际土壤为材料, 利用选择性培养基分离筛选多功能菌株, 并利用生理生化和分子生物学相结合的方法进行鉴定?采用平板对峙法测定筛选获得的菌株对几种植物病原真菌的拮抗效果, 同时通过盆栽试验和发芽试验研究其对番茄幼苗和种子的促生效果, 从而挖掘兼具促生防病功能的植物根际促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)?经筛选获得一株具有溶磷及分泌生长素(indole-3-acetic acid, IAA)能力的细菌菌株S2, 经鉴定该菌株属于克雷伯氏菌属Klebsiella, 其对禾谷镰孢Fusarium graminearum, 玉蜀黍平脐蠕孢Bipolaris maydis等3种植物病原真菌具有一定的拮抗效果, 菌株发酵液浓度为1×104?2×104 cfu/mL时对番茄种子和幼苗的促生效果最好?综上, 菌株S2 是一株新型且兼具促生防病效果的多功能PGPR菌株, 该结果为绿色现代农业开发土壤微生物菌肥和植物生长调节剂提供优质菌源参考?     

在水分胁迫下根际促生菌A2对小麦萌芽期和苗期的促生效应

为了明确根际促生细菌A2 对植物生长的促生效应,通过室内发芽试验,以PEG6000 4 个浓度处理条件,对A2 菌株3 种发酵产物浸种处理的小麦,采用“胚芽鞘长度法”测定种子发芽势、发芽率、胚芽鞘抗旱指数,同时测定其幼苗叶片脯氨酸含量和可溶性糖含量的变化。结果表明PEG6000 浓度为4%时不同浸种处理的小麦胚芽鞘长度、发芽率、叶片脯氨酸含量、可溶性糖含量等各项指标均无显著差异,PEG6000 浓度为12%时,A2 菌株发酵液浸种的小麦发芽率比无菌水对照组高14.93%,其幼苗叶片脯氨酸含量和可溶性糖含量分别比对照高66.55%,66.92%。说明随着PEG6000 浓度的增加不同浸种处理间的各项指标差异显著或极显著,A2 菌株促进植物生长的同时诱导植物产生抗性物质从而适应不利环境。     

武夷菌素生物合成调控基因wysPIII的功能

为了深入研究武夷菌素生物合成调控机理，通过筛选对武夷菌素产量有影响的基因，明确基因的功能，利用分子育种技术来获得武夷菌素高产菌株。本研究通过基因敲除和过表达技术，获得了wysPⅢ基因的缺失突变株、互补菌株和过表达菌株，验证了该基因在武夷菌素生物合成过程中的功能和武夷菌素产量的关系。结果表明：wysPⅢ基因的过表达菌株生长速率加快，产孢时间提前，而缺失突变株较野生菌株生长变慢，产孢量下降，孢子颜色由正常的深灰色变为灰白色，菌丝变稀疏，但是构建好的菌株与野生型菌株相比，武夷菌素产量没有显著变化。由此可知：wysPⅢ基因调节菌株的生长和产孢特征，而不影响武夷菌素的产量，过表达菌株生长速率加快可缩短武夷菌素发酵时间，降低生产成本。     

甲基营养型芽孢杆菌NKG-1可湿性粉剂的制备及药效研究

为了制备甲基营养型芽孢杆菌NKG-1可湿性粉剂,评价其防病促生效果。试验以NKG-1为试材,通过筛选载体和助剂,利用混料设计确定可湿性粉剂的最优配方,并进行药效测定。结果表明：NKG-1可湿性粉剂的最佳载体为白炭黑,最佳助剂为烷基萘磺酸盐甲醛缩聚物和嵌段共聚物混合物(Morwet D-500)及烷基萘磺酸盐(Petro AA)。混料设计确定了最优质量配比为：白炭黑：Morwet D-500：Petro AA=72:16:12。药效试验结果表明：NKG-1可湿性粉剂100倍液处理番茄植株后,其鲜重、干重、株高以及根长分别较对照增加了53.34%、61.01%、88.02%、78.53%,对番茄灰霉病的平均防治效果高达82.02%。本研究确定了甲基营养型芽孢杆菌NKG-1可湿性粉剂的最优配比,评测了制剂的药效,为NKG-1的生产应用奠定了试验基础。     

武夷菌素对活体微生物农药的影响

本文以武夷菌素为主要对象,以牛津杯抑菌测试法和菌丝生长抑制法观察武夷菌素对几种常见的真菌类活体微生物农药之间的影响。武夷菌素对于真菌孢子的抑制试验结果显示,武夷菌素在高浓度处理下对球孢白僵菌的抑制作用显著大于金龟子绿僵菌,其中对球孢白僵菌的最小抑菌浓度为400 mg/L,对金龟子绿僵菌的最小抑菌浓度为200 mg/L。武夷菌素对绿色木霉、哈茨木霉、淡紫拟青霉菌丝生长率的抑制试验结果显示：武夷菌素100 mg/L浓度对于三种真菌菌丝生长的抑制率分别为64.6%、48.6%、39.2%,进行毒力回归方程计算,数据表明武夷菌素对绿色木霉的EC₅₀为57.13 mg/L,对哈茨木霉的EC₅₀为109.81 mg/L,对淡紫拟青霉的EC₅₀为170.03 mg/L。武夷菌素在防治病害过程中实际用药量约100 mg/L,会对金龟子绿僵菌、球孢白僵菌、绿色木霉、哈茨木霉和淡紫拟青霉产生不同程度的抑制,建议应错开使用。本研究所获得的结果对指导武夷菌素及活体微生物农药的生物防治应用具有重要的意义,为生物防治技术集成提供理论基础。