基于Gateway技术的植物表达载体的构建

【目的】为方便基于植物瞬时表达技术的高通量功能基因筛选,利用Gateway技术实现植物表达载体和表达文库的构建,将35S启动子和Gateway技术入门载体pDONR222的同源重组区连接到植物表达载体pCAMBIA0380上,构建Gateway技术兼容的植物表达载体。【方法】分别扩增35S启动子与pDONR222上attP特异识别序列之间的功能区,并将其依次连入根癌农杆菌(Agrobacterium tume faciens)介导的植物表达载体pCAM-BIA0380的多克隆位点区,利用带有attB特异识别区域的GUS基因,对构建的载体功能进行测试。【结果】成功构建了基于Gateway技术的植物表达载体p1104D;载体重组基因的选择性测试结果表明,p1104D对目的基因片段的大小无严格选择性;载体重组效率测试结果表明,p1104D重组平均滴度为5.11×105cfu/mL;GUS报告基因瞬间表达试验结果表明,改造后的载体可以实现目标基因的顺利表达。【结论】基于Gateway技术的植物表达载体p1104D的构建,为实现cDNA文库的高效构建和目标基因的高通量功能筛选提供了可能,有望推动植物-病原互作研究中关键基因的鉴定与克隆。     

棉铃疫病潜伏侵染的研究

分离试验确证,存在于抗病阶段棉铃上限制性褐色坏死病组织中,疫病菌并不完全失活,说明该病菌存在潜伏侵染.州铃的抗病性表现在抗扩展上.棉铃的抗病性与其发育阶段和环境条件密切相关.花后35天以上的棉铃感病,而花后25天以前的幼铃高度抗病.初步认为,疫病菌侵染后诱导发生的病变特别是酮溶性植物抗毒素的累积,是病菌潜伏侵染及棉铃阶段抗病性的重要机制.高湿等极端环境能诱发抗病阶段的幼铃高度感病.     

农杆菌介导的烟草瞬时表达影响因素研究

通过探究根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的烟草瞬时表达体系的影响因素,确定烟草瞬时表达的最佳条件,为目的基因的功能研究提供技术支持。利用马铃薯晚疫病抗性基因RB和致病疫霉菌效应基因Avrblb 1作为报告基因,采用农杆菌介导的注射渗透法,摸索农杆菌菌悬液OD600值和菌系(遗传背景)、烟草品种及其生长时期等因素,确定烟草高效的基因瞬时表达条件。研究结果表明:介导烟草基因瞬时表达的根癌农杆菌菌悬液适宜OD600值为0.3~0.8;在菌悬液OD600值为0.1及以上时,AGL1、GV3101和C58C1介导的报告基因瞬时表达效率相似,均引发较强的叶片坏死反应;在农杆菌菌悬液OD600值小于0.1时,AGL1介导的瞬时表达效率最高。测试的烟草品种都具备较高的瞬时表达效率,苗龄6~8周的烟草适合分析。通过测试农杆菌菌悬液OD600值和菌系(遗传背景)、烟草品种及其生长时期等因素,确定本氏烟和普通烟均可实现基因高效瞬时表达的条件。     

马铃薯StCYP83B1基因过表达载体构建及遗传转化

旨在为解析马铃薯StCYP83B1基因的免疫功能提供重要材料基础,从四倍体马铃薯栽培种‘大西洋’的cDNA中克隆到StCYP83B1基因,将其与融合mCherry标签的35S::pART27重组载体连接,构建p35S::StCYP83B1 mCherry植物过表达载体,并通过农杆菌介导的本氏烟瞬时表达体系确认该蛋白的表达;利用农杆菌介导的马铃薯遗传转化方法,将p35S::StCYP83B1 mCherry转入马铃薯中,随机挑选3株转基因植株进行鉴定：PCR检测证明StCYP83B1已整合到马铃薯基因组中,反转录实时定量PCR检测表明StCYP83B1在转化植株中的转录水平比未转化的对照植株上调40~49倍,免疫印迹检测表明StCYP83B1蛋白可以在转化植株中正常表达。同时,对转化马铃薯植株及微型薯的表型鉴定表明,StCYP83B1过量表达并不影响马铃薯的正常生长发育。该稳定转化马铃薯植株的获得为后续深入解析StCYP83B1基因的免疫功能及作用机制奠定了重要材料基础。     

亚硝基谷胱甘肽还原酶 GSNOR1正调控植物对疫霉菌的抗性

疫霉属（ Phytophthora）卵菌引致马铃薯晚疫病等作物灾难性病害,严重威胁作物的可持续生产。由于病菌毒性变异,导致品种抗病性丧失问题突出。因此,挖掘植物广谱和持久抗病基因,并探索其在抗病育种中的有效利用具有重要的科学意义。亚硝基谷胱甘肽还原酶1（GSNOR1）是植物氮信号通路中高度保守的关键还原酶,其参与调节r基因介导的植物抗性和非寄主抗性。然而, GSNOR1参与抗疫霉菌的免疫功能和作用机理尚不清楚。本研究中,借助拟南芥与寄生疫霉菌互作的模式体系,首先发现拟南芥T-DNA插入突变体 gsnor1-3对寄生疫霉菌呈现感病表型。进一步利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）降低烟草叶片中 GSNOR1同源基因的表达量,在此基础上,通过抗病表型分析以及一系列抗性相关功能的检测,结果表明,沉默本氏烟草 GSNOR1同源基因能够在寄生疫霉菌侵染植物的过程中削弱植物体内的活性氧（ROS）迸发、病程相关基因（PR genes）的诱导表达以及MAPK信号转导,从而增强了植物对疫霉菌的感病性。本研究揭示了植物 GSNOR1对疫霉菌具有高度保守的抗性功能,并初步解析了 GSNOR1正调控植物抗疫霉菌的作用机理,为进一步探索 GSNOR1在马铃薯抗晚疫病中的功能及其在抗病育种中的有效利用奠定了重要的理论 基础。     

棉铃疫病病菌侵染行为观察

本研究观察了棉铃疫病病菌（ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｂｏｅｈｍｅｒｉａｅ）的侵染前行为及其侵染过程，表明温度和淋溶物影响孢子囊的萌发方式，１８～２０℃条件下全行间接萌发，２２～２４℃条件下表现孢子囊直接萌发量增多，并迅速产生次级孢子囊。人工游动孢子接种证明该病菌主要为害棉铃，此外还能有效地侵染棉苗及成株叶片。在铃表在附着胞形成较棉叶上迅速，且有次级乃至三级附着胞产生。棉铃气孔是病菌入侵的主要途径；在叶表该病菌气孔保卫细胞与表皮细胞毗邻的垂周壁侵染。接种体浓度愈高，游动孢子侵染棉叶的潜育期愈短，２４小时即能检出新生孢子囊，孢囊梗由气孔伸出；与此同时，在病组织中有性器官也开始形成。在棉病铃壳、内果皮、铃纤维以及种皮中均见有卵孢子。田间遗留的棉花枝叶有富集菌源作用。     

根部内生真菌—寄生疫霉—拟南芥互作模式体系的构建与鉴定

为构建根部内生真菌—寄生疫霉—拟南芥三方互作模式研究体系,以影响马铃薯晚疫病害发生的潜在内生真菌雪球微座孢(Microdochium bolleyi)为例,利用WGA-Alexa Fluor^○R488染色和带有GFP标记的寄生疫霉(Phytophthora parasitica)转化菌株,通过荧光显微镜观察分析M.bolleyi侵染拟南芥根部以及M.bolleyi与寄生疫霉和拟南芥根部三方互作的细胞学特征;利用皿内平板拮抗测试初步分析内生真菌M.bolleyi对致病疫霉(Phytophthora infestans)的抑制效果,并进一步利用皿内拟南芥与真菌M.bolleyi和寄生疫霉三方互作体系,鉴定分析真菌M.bolleyi对植物与寄生疫霉亲和互作的影响。结果表明,真菌M.bolleyi可成功侵染并定殖于根组织,而未引发植物细胞坏死现象,说明M.bolleyi具有典型的内生真菌特征;相比于对照预处理,真菌M.bolleyi预处理能够抑制寄生疫霉在拟南芥根部的定殖和扩展,初步揭示真菌M.bolleyi在植物与疫霉菌互作中的影响作用;真菌M.bolleyi不仅对致病...     

中国小麦条锈菌流行小种的RAPD分析

 用随机扩增多态性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）技术对中国小麦条锈菌（Puccinia striiformis f.sp.tritici）流行小种的11个模式分离系（CY17，CY19，CY21，CY22，CY23，CY25，CY26, CY27，CY28，CY29，水源11-1）以及5个分属于两个新发现小种CY30和CY31的分离系进行了基因组DNA多态性分析。用17个10-核苷酸随机引物共获得114个RAPD标记，其中75.4%表现多态性。选取共中的58个RAPD标记通过系统聚类分析确定了供试分离系间的亲缘关系，并与以毒性标记为基础确定的分离系间的演化关系进行了比较。结果表明，DNA多态性与毒性多态性之间没有相关性。利用RAPD标记检测到了小种间以及小种内的遗传变异，有些引物扩增到了分离系特异的RAPD特征图谱。与其它基因组多态性分析技术相比，RAPD分析可为小麦条锈菌的遗传分析提供大量的分子标记，且具有技术操作简单、快速、安全以及仅需微量的模板DNA等优点，对该活体营养病菌的群体遗传结构分析极 具潜力。     

分子伴侣4-苯基丁酸通过抑制内质网应激减轻寄生疫霉菌对植物的侵染

旨在利用内质网应激分子伴侣4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid, 4-PBA）探究内质网应激对疫霉菌侵染寄主植物的影响机制。以拟南芥与寄生疫霉菌的亲和互作为研究体系,分析野生型Col-0植株响应寄生疫霉菌侵染的鲜质量及生长表型变化以及4-PBA对其影响;利用实时荧光定量qRT-PCR技术分析4-PBA对内质网应激标记基因 BiP3的诱导表达以及寄生疫霉菌侵染植物的影响;通过4-PBA处理拟南芥幼苗和活体植株,分析其对植物生长表型的影响。结果表明,分子伴侣4-PBA作为内质网应激修复剂,在不影响植物正常生长的同时,不仅能够减轻寄生疫霉菌侵染引发的植物生长受阻和 BiP3基因的诱导表达等内质网应激标志性事件,还对寄生疫霉菌在植物体内的扩展和定殖具有抑制作用,从而减轻植物的感病性。研究结果有助于揭示内质网应激对植物与微生物互作的影响机制,也为开发新型药物靶点用于作物疫霉属卵菌病害的绿色综合防控提供了新思路。     

致病疫霉菌RXLR效应蛋白AVR1-like寄主靶标的酵母双杂交筛选

由卵菌病原物致病疫霉菌引起的马铃薯晚疫病是造成马铃薯毁灭性损失的病害.为了筛选致病疫霉菌RXLR效应蛋白AVR1-like(AL)的寄主靶标,以致病疫霉菌88069菌株的DNA为模板,克隆致病疫霉菌效应蛋白AL,并将其成功构建到pGBKT7载体上,形成诱饵载体.将pGADT7和重组诱饵载体共转化到酵母感受态AH109中...