细胞自噬与猪流行性腹泻病毒相互作用的研究进展

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是冠状病毒科甲型冠状病毒属的一种有囊膜的单股正链RNA病毒，对全世界养猪业造成了巨大的损失。PEDV与宿主之间的致病机制和免疫调节相互作用仍不清楚。有研究表明冠状病毒可以诱导细胞发生自噬，并且与病毒的复制有着密切的联系，病毒与细胞自噬之间的关系十分复杂，虽然病毒感染与细胞自噬之间的关系研究比较广泛，但细胞自噬在PEDV感染中的作用报道较少。研究PEDV与细胞自噬的相互作用可以加速对PEDV感染入侵机制的理解，为未来研究病毒治疗和抗病毒药物提供新的思路。     

低致病性禽流感病毒与禽病原性大肠杆菌的联合感染试验

以１０＾５．１７ＥＬＤ５０的低致病性禽流感病毒（ｍｉｌｄｌｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ，ＭＰＡＩＶ）气管内注射１０日龄ＳＰＦ鸡，２４ｈ后，重复感染一次，４８ｈ后，气管内注射禽病原性大肠杆菌３５３（０１８）、１２０（０１８）、０３７（０７８）、１６６（０７８）、０５５８（０２）、５３６（０８８）、１３２（０１１）和１７３（０２６）株，３×１０＾７ＣＦＵ／羽，连续观察５ｄ。结果：ＭＰＡＩＶ单独感染组死亡率为１３．３３％各大肠杆菌单独感染组的死亡率分别为３５３：１００．００％、１２０：６０．００％、０３７：８０．００％、１６６：８６．６７％、０５８：１０．００％、５３３６：９３．３３％、１３２：８６．６７％和１７３：２０．００％；ＭＰＡＩＶ与上述各分离株的联合感染组死亡率分别为１０     

猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的研制

以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)JYC株全病毒作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,融合后经间接ELISA进行杂交瘤筛选,共获得4株能分泌针对PRRSV单克隆抗体(简称单抗)的杂交瘤细胞株,分别命名为2G7、6G7、7F2和7E8,其亚类均为IgG1;单抗腹水的间接ELISA效价分别为10×215、10×211、10×215、10×214;间接ELISA试验结果表明,4株单抗与实验室保存的江苏地区临床分离的12株PRRSV以及VR-2332均发生特异性反应,而与猪常见其他病毒如猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(HCV)、猪圆环病毒2(PCV2)均无反应性;间接荧光试验表明,4株单抗与Marc-145细胞感染的PRRSV均呈特异性的荧光反应。因此这些单抗均可用于ELISA方法以及间接荧光试验,从而为建立快速、敏感的PRRSV的抗原检测方法奠定了基础。     

鸡Toll样受体15单克隆抗体的制备及其初步应用

旨在制备鸡Toll样受体15（ChTLR15）的特异性单克隆抗体（mAb）,并初步应用。利用PCR技术扩增ChTLR15第162-386位氨基酸,克隆于载体pET-30a中进行诱导表达,获得高纯度的重组ChTLR15（162-386 aa）蛋白。然后采用皮下多点注射方式将ChTLR15免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠,常规获得针对ChTLR15蛋白的单克隆抗体。运用原核表达系统对ChTLR15基因进行截短表达,对单克隆抗体针对的ChTLR15抗原表位进行鉴定。利用6C7株单克隆抗体以激光共聚焦显微技术对鸡HD11细胞进行定位,同时,利用免疫组化技术确定ChTLR15在鸡部分组织中的分布情况。结果表明：成功构建重组质粒pET-30a-ChTLR15（162-386 aa）,经IPTG诱导表达后,获得以包涵体形式存在的约26 ku的重组蛋白ChTLR15（162-386 aa）。方阵试验表明,最适血清稀释度为1：6 400,最适抗原包被浓度为0.35 μg·mL^-1。采用有限稀释法进行4轮筛选,最终获得4株针对ChTLR15蛋白的单克隆抗体,将其以2G4、6C7、6D10、7C4进行命名。2G4与6C7的亚类为IgG2a,6D10与7C4的亚类为IgG1。Western blot结果显示,4株单抗均能与ChTLR15发生特异性反应,而不与其他受检蛋白反应。运用原核表达系统对ChTLR15（162-386 aa）进行截短表达,对ChTLR15单克隆抗体的抗原表位进行鉴定。结果显示,单抗2G4与7C4识别的抗原表位为²³⁰QLGTVLEF²³⁷,6C7与6D10识别的抗原表位为²⁴⁵EMDLLS²⁵⁰。细胞定位结果显示,ChTLR15蛋白位于细胞表面。免疫组化结果显示,健康对照鸡肝、脾、肺、肾均有微弱阳性染色,禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli,APEC）感染鸡肝、脾、肺、肾阳性染色有所增强。本研究通过淋巴细胞杂交瘤技术成功获得4株抗ChTLR15蛋白的单克隆抗体,通过截短免疫原蛋白法对其识别的线性表位进行鉴定,可用于进一步研究ChTLR15的结构与功能,为后续信号通路、免疫机理、疫苗研发等相关领域的研究提供了有力工具。     

禽大肠杆菌病的研究进展

大肠埃希氏杆菌是家禽最常见的病原菌之一，可引起家禽胚胎死亡、脐炎、败血症、肉芽肿、卵黄性腹膜炎和全眼球炎等一系列表现，给养禽业造成严重的经济损失。笔者在承担国家自然科学基金项目“禽病原性大肠杆菌外膜蛋白型与免疫保护关系的研究”和‘噙源性大肠杆菌分离株致病机理的研究”的基础上，近年来对该病的流行病学、病原的遗传相关性、免疫特性及免疫保护机理等进行了研究，现将部分内容介绍如下。一、流行病学研究有关禽大肠杆菌病流行病学的研究，国内已有不少报道。从这些报道看，我国分离到的禽源性大肠杆菌的血清型众多，且不…     

禽病原性大肠杆菌O2和O78外膜蛋白型的初步研究

从１１个禽败血症Ｏ２和Ｏ７８大肠杆菌分离株提取的主要外膜蛋白（ＯＭＰ），出现了３个ＯＭＰ型。其中６个Ｏ２分离株、５个Ｏ７８分离株可分别归为２个ＯＭＰ型，但有１个ＯＭＰ型为两者所共有，结果表明，从江苏地区所分离到的禽病原性大肠杆菌具有多样性的ＯＭＰ型，而且这２个血清型菌株中存在着共同的ＯＭＰ型。     

实验性鸡大肠杆菌病的免疫组化检测

用致病性大肠杆菌 O1 8分离株和 /或低致病性禽流感病毒 (Mildly pathogenic avian influenza virus,MPAIV)接种 1 0～ 1 2日龄 SPF鸡 ,细菌接种后 1～ 96h对试验鸡的气管、肺、气囊、胸腺、法氏囊、脾脏、肝脏和肾脏的石蜡切片进行间接酶标抗体染色 ,发现大肠杆菌接种组、混合接种组的气管、肺在接种后 1 h可检测到细菌抗原 ,混合接种组检测到的细菌更多 ,存在时间更长。结果表明 :气管、肺和气囊是鸡大肠杆菌定居的场所 ;MPAIV可延长细菌在气管、肺和气囊中定居的时间 ,使鸡大肠杆菌病进一步加重     

猪圆环病毒重组Cap蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

利用重组杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达PCV2-ORF2基因,并以构建的重组杆状病毒为免疫原,通过杂交瘤技术,研制针对PCV2的单克隆抗体,为建立准确快速的PCV2诊断方法奠定基础。首先将PCV2-ORF2基因克隆到杆状病毒的转移载体pFastBacTM1中,然后将其转化入大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中,与DH10Bac中的穿梭载体Bacmid发生转座,通过抗性和蓝白斑筛选,得到重组杆状病毒质粒reBacmid-ORF2,通过脂质体介导reBacmid-ORF2转染Sf9细胞,成功获得了表达PCV2-ORF2基因的P1代重组杆状病毒。将所获得的重组杆状病毒经Vivaflow200浓缩后,免疫6~8周龄BALB/c小鼠,取其脾脏与Sp2/0细胞融合,以IFA进行筛选,经多次亚克隆后得到3株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞,分别命名为5H6、4E2和5F7。通过IFA、IPMA及Western-blot试验对3株单抗特异性进行分析鉴定。结果显示,3株单抗均能与PCV2-Cap蛋白产生特异性的反应,并利用流式细胞术初步建立了对PCV2毒株感染PK15细胞的检测方法,从而为快速检测PCV2病毒奠定了基础。     

大肠杆菌猪水肿毒素B亚单位基因的克隆与鉴定

根据已知大肠杆菌志贺氏菌样毒素Ⅱ型变异体Ｂ亚单位（ＳＬＴ－ＩＩｖＢ）基因序列,设计并合成３条２对引物,以大肠杆菌Ｏ１３８基因组为模板,通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）分别扩增出２０４ ｂｐ的基因序列及包含一段信号肽的２６１ ｂｐ基因序列。将这两段ＤＮＡ分别克隆进表达性载体质粒ＰＹＡ３３３４的ＥｃｏＲⅠ和ＢａｍＨⅠ位点之间,经地高辛标记探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和酶切分析鉴定,并对两条扩增片段进行序列     

鸡痘病毒载体复制非必需片段优化及强启动子的筛选

以痘苗病毒启动子Ｐ７．５调控的β－半乳糖苷酶基因为检测基因,分别插入三个复制非必需片段构成重组质粒,脂本介导转染鸡痘病毒中国疫苗株２８２Ｅ４感染原代鸡胚成细胞（ＣＥＦ）单层,蓝斑选纯化病毒;将重组病毒感杂次代ＣＥＦ,收获细胞后制备提取物,检测其中的β－半乳糖苷酶的活性,由此得到一个基因表达效率高的复制非必需片段ｐＦＰＶ７ｓ。根据痘苗病毒天然启动子Ｐ７．５的结构,人工合成４条寡核苷酸,形成一个早期和