一种新型对虾白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒复合快速检测技术-二温式多重PCR的建立

摘要：本研究建立了一种二温式多重PCR技术，用于对虾白斑综合症病毒（white spot syndrome virus ,WSSV）和桃拉综合症病毒(taura syndrome virus ,TSV)的复合检测。根据对虾白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒的基因序列分别设计了两对特异引物F1 、R1和 F1、 R2，利用该PCR能特异扩增出WSSV和TSV基因片段，结果表明：二温式多重PCR技术具有较高的特异性和敏感性，最低能检测到WSSV核酸模板10pg,TSV核酸模板100pg，且对其它一些对虾病原呈现阴性。     

间接ELISA技术检测近江牡蛎病原一类立克次体

以近江牡蛎病原一类立克次体为抗原，制备鼠抗血清，利用辣根过氧化酶标记的羊抗鼠血清（HRP-IgG）为酶标二抗。建立了检测近江牡蛎类立克次体的间接ELISA快速检测方法。结果表明，应用间接ELISA技术检测近江牡蛎类立克次体有较高的灵敏度，最低的检测量为50ng的全菌抗原蛋白量。同时交叉反应试验表明该方法具有较高的特异性。利用建立的间接ELISA技术，对50份自然患病的近江牡蛎鳃组织进行类立克次体检测，阳性率为89％。     

养殖刺参溃疡病病原学研究

自2002年冬季以来,山东、辽宁等省的养殖刺参几乎每年冬天都大规模爆发溃疡病。本文研究了刺参溃疡病的特征和症状,从病参体表和体内分离出优势菌,经回归感染证实其就是引发本次刺参溃疡病的病原菌。对病原菌进行鉴定发现,该菌革兰氏染色呈阴性,电镜下观察呈短杆状,极端单鞭毛,综合研究该菌在形态、生理生化等方面的特性,确认分离到的病原菌为交替假单胞菌,交替假单胞菌作为养殖刺参的病原菌在国内外属首次报道。     

泥蚶金属硫蛋白的鉴定、原核重组表达及其组织细胞分布

采用RT-PCR方法扩增、克隆和鉴定了泥蚶(Tegillarca granosa)的金属硫蛋白(Metallothionein,MT)基因(TgMT)的开放阅读框(ORF)。基于金属硫蛋白氨基酸序列构建的系统进化树表明,泥蚶和魁蚶(Scapharca broughtonii)的亲缘关系最近。利用ORF序列,构建原核重组表达质粒。重组质粒经PCR、酶切鉴定及测序验证后转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导,表达重组蛋白,重组蛋白的分子量约为28.3 kD。可溶性分析表明重组蛋白主要以可溶性形式存在。用His-tag柱亲和纯化重组蛋白,并利用重组蛋白制备了兔抗血清。Real-time PCR和Western blot实验表明,金属硫蛋白在泥蚶的各个组织中都有表达,并且在消化腺中的表达量最高。采用激光共聚焦显微镜,对泥蚶的消化腺进行免疫组化定位分析,发现泥蚶的MT主要存在于消化腺腺管上皮细胞的胞质中。泥蚶MT的克隆和表达研究为进一步研究该蛋白在环境监测中的作用、探讨细胞解毒的分子生物学机制奠定了基础。     

DAD1和AIF-1细胞因子在鱼类中的研究进展

细胞因子是一类由多种细胞合成或分泌的可溶性蛋白与多肽物质,具有调节多种细胞生理功能的作用.抗细胞凋亡因子(DAD1)是一种内源性细胞凋亡抑制基因.同种移植炎症因子(AIF-1)是一种由干扰素r诱导的钙离子结合蛋白.本文概述了DAD1和AIF-1的结构特点、功能表达、生物学作用及在水产动物中的最新研究进展,旨在为水产动物细胞因子的研究和有效应用提供参考资料.     

泥蚶血细胞的形态结构特征及部分免疫功能

利用光镜、透射电镜、扫描电镜及流式细胞仪技术对泥蚶血细胞形态结构以及吞噬活性进行了研究。根据细胞大小、形态结构、颗粒特点,光镜下可将血细胞区分为红色颗粒细胞(占89.67%)、嗜碱性颗粒细胞(占7.05%)、透明细胞(占3.28%)3种主要类型。健康泥蚶血淋巴中血细胞平均密度为(3.29±0.82)×10⁶ /mL。透射电镜下观察到颗粒细胞Ⅰ型、颗粒细胞Ⅱ型、无颗粒细胞;扫描电镜观察下,细胞表面光滑,部分细胞表面有小的突起物。用流式细胞仪检测出P1(13.13%)亚群和P2(78.83%)两个细胞亚群以及没有固定形态的细胞(近8%)。利用APIZYM 试剂盒对健康泥蚶血细胞及血清中的19种酶进行检测,在血细胞中检测到11种酶,在血清中检测到了13种酶,经酵母聚糖刺激后,碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、类脂脂酶、N-乙酰葡萄糖胺酶在血细胞和血清中的水平大幅升高。体外吞噬实验观察显示,红色颗粒细胞对酵母聚糖具有明显的吞噬能力,嗜碱性颗粒细胞和透明细胞吞噬作用不显著;在经嗜水气单胞杆菌刺激后,嗜碱性颗粒细胞出现大量聚集现象,透明细胞能吸附颗粒物。吞噬活性研究表明,温度、盐度对泥蚶血细胞的吞噬活性有显著的影响,在泥蚶适宜生长温度(13~30 ℃)区间和最适盐度(20.0~26.2)×10^-12区间,血细胞吞噬活性达到最高值。     

泛影葡胺密度梯度离心法纯化近江牡蛎类立克次体

用国产泛影葡胺做介质，通过差速离心和密度梯度离心从患病近江牡蛎的鳃、外套膜、肝胰腺组织中纯化类立克次体。纯化的类立克次体在透射电镜下观察，20％-25％和25％-30％之间的条带为纯净的类立克次体，大多数呈球形、椭球形，偶见哑铃状（处于二分裂阶段）。纯化的类立克次体细胞形态完整，在光滑的细胞壁外围有一层疏松的粘液层，而且多个类立克次体常聚集在一起。利用APIZYM半定量法对类立克次体进行酶谱分析，检测到了11种酶，包括碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、酯酶（C4）、类脂酯酶（C8）、亮氨酸芳胺酶、萘酚AS—BI-磷酸水解酶、β-半乳糖苷酶、N-乙酰葡萄糖胺酶、β-果糖酶、β-糖醛酸苷酶和缬氨酸芳胺酶。本实验证明，国产泛影葡胺是直接从患病贝类组织中纯化类立克次体的良好介质。     

中国金鱼遗传多样性研究中AFLP反应体系的优化

探讨了AFLP(Amplified fragment length polymolphism)标记技术在中国金鱼基因组DNA提取、模板浓度、酶切时间的一些优化改进,建立了一套稳定的实验体系,在49对引物组合中筛选出6对多态标记丰富、稳定性好的引物组合,并用这些引物对中国金鱼遗传多样性进行了研究.     

间接ELISA技术检测近江牡蛎病原-类立克次体

以近江牡蛎病原-类立克次体为抗原,制备鼠抗血清,利用辣根过氧化酶标记的羊抗鼠血清(HRP-IgG)为酶标二抗,建立了检测近江牡蛎类立克次体的间接ELISA快速检测方法.结果表明,应用间接ELISA技术检测近江牡蛎类立克次体有较高的灵敏度,最低的检测量为50 ng的全菌抗原蛋白量.同时交叉反应试验表明该方法具有较高的特异性.利用建立的间接ELISA技术,对50份自然患病的近江牡蛎鳃组织进行类立克次体检测,阳性率为89%.