卵泡刺激素剂量依赖性表达基因的筛选

为开发能高效检测卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)制品生物活性的新方法,选取猪卵泡颗粒细胞,利用转录组测序技术对比FSH处理组(40 m IU/m L)和空白对照组细胞中基因的表达情况,分析并获得大量受FSH调控的候选基因,运用荧光定量聚合酶链式反应验证FSH处理后显著上调的基因,并进一步利用FSH浓度梯度(0、20、40、60、80、100 m IU/m L)处理卵泡颗粒细胞。结果显示,基因OLR1、LHCGR、SCARA5和S100A12的表达量呈现FSH浓度依赖性升高。在3倍递增的FSH浓度梯度(0、1、3、9、27、81、243、729 m IU/m L)下观察各基因表达量的变化,发现在0~243 m IU/m L的FSH浓度范围内,LHCGR基因的表达量与FSH浓度呈高度线性相关(R2=0.982)。因此,可通过检测FSH刺激条件下细胞中LHCGR基因的表达量,来评估FSH制品的生物学效价。     

精准定时输精对后备母猪早期胚胎发育与繁殖性能的影响

为探讨精准定时输精(fixed-time artificial insemination, FTAI)对后备母猪早期胚胎发育和繁殖性能的影响,试验1选取自主培育的金乌猪后备母猪43头,随机分为2组,其中,对照组24头,为自然发情,观察后人工配种(artificial insemination, AI);试验组19头,为精准定时输精组。分别于0 h(停喂烯丙孕素)、42 h [肌注孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin, PMSG)]、122 h [肌注促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone, GnRH)]静脉采血,检测孕酮(progesteron, P4)、雌二醇(estradiol, E2)、促卵泡激素(follicle-stimulating hormone, FSH)和黄体生成素(luteinizing hormone, LH)的含量;在配种后33 h,分别屠宰对照组和试验组4头后备母猪,回收受精卵进行体外培养,其余后备母猪继续饲养并进行分娩与产仔情况追踪。结果显示,从停喂烯丙孕素至42 h和122 h,P4值呈下降趋势但差异不显著(P>0.05);停喂烯丙孕素至停喂后42 h,E2值从80 pmol·L^-1显著(P<0.05)下降至58.3 pmo·L^-1,而在PMSG作用后又急剧升至134.07 pmol·L^-1(P<0.01);FSH值未见显著变化(P>0.05);停喂烯丙孕素至停喂后42 h,LH值由0.09 IU·L^-1升至0.12 IU·L^-1(P>0.05),PMSG作用后又降至0.09 IU·L^-1(P>0.05),呈先升后降的趋势,符合正常生理周期的变化趋势,表明用药合理无副作用。屠宰后卵巢排卵点计数结果显示,试验组17.5枚,对照组15.25枚,差异不显著(P>0.05);试验组平均窝均总产仔数、活仔数与对照组相比未见显著差异,但相对提高1.05头。试验2选取大长后备母猪189头,处理方式同试验1,随机分为试验组94头、对照组95头,试验组活仔较对照组约提高0.58头(P>0.05),断奶成活率提高2.99百分点。综上所述,精准定时输精程序处理符合母猪生理发情周期特质,可增加排卵数且对早期胚胎发育无不良影响,在提高后备母猪的利用率、增加窝均活仔数和提高仔猪断奶成活率等方面都有一定的积极作用,值得进一步优化研究和推广应用。     

家禽的转基因技术研究

转基因技术的研究虽然备受争议,但是由于具有广阔的应用前景,近年来发展十分迅速。与哺乳动物相比,禽类具有特殊的生殖系统,因此家禽的转基因研究相对较为滞后。影响转基因家禽研制的关键因素在于表达载体的选择和外源基因的导入方式,这决定了如何获得较高的孵化率和转染率。笔者对目前用于转基因家禽制备的常用载体、转基因家禽制备的方法以及转基因鸡的后续孵化技术进行了综述。     

一种高效制备慢病毒表达载体的方法

慢病毒表达载体具有感染宿主广和基因组整合效率高的优点,因此在转基因动物的制备中得到广泛应用.本研究构建了含有红色荧光和绿色荧光的慢病毒表达载体,用磷酸钙转染法将三质粒慢病毒载体转染293T细胞,转染效率达72%,降低了慢病毒的生产成本.在进行慢病毒的浓缩与纯化时,通过超速度离心和超滤相结合的方法,在150 mL的慢病毒原液中经纯化后得到80 μL效价为2.38×109 TU/mL的慢病毒颗粒.获得的高效价双荧光慢病毒表达载体可为后续双基因转基因动物的制备提供可靠的制作途径与检测基础.     

犬细小病毒病的研究进展

随着人民生活水平的提高，养犬、猫者日益增多，犬的疾病逐渐被人们所重视，对犬的各种疾病的研究也在不断深入。作者从病原学、流行病学、生物学特性、诊断方法及治疗等角度对犬细小病毒病的病原学研究进行综述。     

禽的甲型流感病毒感染

禽的甲型流感病毒感染已给世界的禽的养殖业带来了巨大的经济损失,目前,已经证实高致病性的禽流感病毒(H5、H7亚型)可直接感染人类,给人类的健康和公共卫生事业带来巨大的影响。流感病毒的发生与其形态、结构、病毒的生态学与流行特征、病毒的复制与致病力以及病毒的抗原性变异与进化有密切的关系。     

抗禽流感病毒药物的活性筛选研究

目的:观察药物对禽流感病毒抑制作用。方法:固定病毒稀释药物的微量中和实验法,采用体外细胞培养技术,将系列稀释的药物与固定量病毒在细胞上感作后,置适宜条件培养5～7d,同时设相应对照,以病毒所致的特异性细胞病变(CPE)作为观察指标,用Reed-Muench法计算中和结果,凡药物能保护细胞不出现特异性病变的定为该药对病毒有抑制作用,测定治疗指数TI值。结果:药物能减少H5N1型的禽流感病毒引起的CPE,药物对照实验也出现同样结果。结论:药物对H5N1型的禽流感病毒有抑制作用。     

卵巢皮质与输卵管上皮细胞对猪卵母细胞体外成熟与体外受精的影响

在猪输卵管上皮细胞(pOECs)与猪卵巢皮质细胞(pOCCs)共培养体系中进行猪卵子体外成熟(IVM),研究比较了pOECs与pOCCs对猪卵母细胞体外成熟(IVM)、体外受精与胚胎发育的影响.结果显示:pOCCs或pOECs参与猪卵子体外成熟可显著提高卵丘扩散与MⅡ期卵子的比例(P＜0.05),然而GV期卵子的比例却没有显著减少(P＞0.05);pOCCs组内成熟卵子的GSH含量显著高于其余各组(P＜0.05),而GSH在pOECs组与对照组之间差异不显著(P＞0.05);尽管pOCCs和pOECs共成熟可显著降低多精入卵的比例(P＜O.05),但是受精率与雄原核形成率(MPN)在各组间却无显著差异(P＞0.05);pOCCs和pOECs共培养均可以显著提高卵裂率与囊胚发育率(P＞0.05),然而囊胚细胞数在处理组与对照组间没有显著性差异(P＞0.05).研究认为,pOCCs与pOECs共培养体系能显著提高猪卵母细胞IVM质量,降低多精入卵的发生,并提高囊胚发育率.     

鸡胚血液原始生殖细胞的分离纯化及鉴定

家禽的原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)是形成精子和卵子的前体细胞,可在性成熟的家禽体内生成精子和卵子,因此家禽PGCs可应用于以PGCs为基础的现代保种技术、转基因技术以及家禽的发育生物学等研究领域,具有重要的科研与应用价值。本研究使用Nycodenz密度梯度离心法在孵化至13~15期的鸡(Gallus gallus)胚血液中分离纯化鸡胚的PGCs,经显微注射针分拣后,PGCs的纯度可达99%以上,细胞直径主要集中于13~15μm;将所分离纯化的PGCs分别通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)染色、高碘酸希夫氏(periodic acid-schiff,PAS)染色及阶段特异性胚胎表面抗原-1(stagespecific embryonic antigens-1,SSEA-1)免疫化学染色进行鉴定,染色结果均出现PGCs所特有的反应;使用活细胞荧光染料PKH26对分离纯化的PGCs进行标记,成功标记的PGCs在荧光显微镜下可观测到红色荧光,将约200个标记后的PGCs,通过腹主动脉注入孵化至14~16期的受体鸡胚中,在孵化至第8天的鸡胚性腺冷冻切片中,可检测到供体PGCs的存在,这一结果表明,所分离纯化的PGCs可定植于受体鸡胚的性腺中。本研究为以PGCs为基础的种质资源保存研究以及转基因技术研究提供了基础资料。     

兔类胚胎干细胞的体外培养

为了确立兔类胚胎干细胞(ESCs-like)体外培养方法,研究探讨了兔囊胚形成环境与饲养层细胞对内细胞团(ICM)增殖、ICM原代集落形成以及集落碱性磷酸酶(AKP)阳性率的影响,并在MEF和REF饲养层上进行了兔ESCs-like的体外培养.结果显示,去除透明带桑葚胚在体外具有较高的囊胚发育率和囊胚贴壁率(P＜0.05),体外发育囊胚ICM原代集落的AKP阳性率却显著低于体内发育囊胚(P＜0.05);与MEF饲养层相比,REF饲养层上ICM原代集落的形成率显著偏低(P＞0.05),但原代集落的AKP阳性率却显著高于其余各组(P＜0.05);MEF饲养层与REF饲养层均支持兔ESCs-1ike的传代培养,但F3代后MEF组中ESCs-like的集落形成率显著高于REF组(P＜0.05).