鸡传染性贫血重组抗原间接ELISA诊断方法的建立

本研究应用重组抗原,成功建立了检测鸡传染性贫血病毒血清抗体的间接ELISA诊断方法.确定了抗原最适包被浓度为5μg/mL,血清最适稀释度为1:100,其作用时间为60min,酶标抗体最适作用时间为60min,S/P≥0.24为阳性,≤0.19为阴性,介于二者之间为可疑的判定标准.该抗原不与鸡其他疾病的10种阳性血清反应,具有良好的特异性;批内重复试验,变异系数小于10%,批间重复试验,变异系数小于15%,具有良很好的重复性;该方法可检出人工接毒后20d的血清抗体,直到试验结束110 d时,仍能检出鸡血清阳性率为81%与全病毒包被抗原ELISA方法的检测结果符合率达92%以上,与进口诊断试剂盒的符合率为97%.本研究为现地免疫鸡群抗体检测和进行CIA流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法.  

传染性法氏囊病超强毒Gx株的致弱研究

本研究成功将鸡传染性法氏囊病超强毒vvIBDVGx株通过SPF鸡胚的快速培育及鸡胚成纤维细胞传代致弱，揭示了vvIBDV从超强毒力向弱毒力转化过程中，其主要结构蛋白VP2基因核苷酸及推导的氨基酸序列的变化规律。对不同代次细胞毒进行了序列分析。发现细胞毒在第7代以前，VP2基因序列没有改变。与欧洲标准超强毒氨基酸同源性达100%；细胞毒第8代，有个别核苷酸发生了改变。但没有影响氨基酸序列；细胞毒第9代是变化复杂的过渡代；10代毒VP2基因与欧洲标准弱毒Cu-1氨基酸序列同源性达97%；以后的细胞适应毒至20代。其VP2基因序列不再改变。致病性实验表明原代毒对4周龄SPF鸡致死率为64%。细胞毒第5代的致死率为60%，而20代毒对鸡无致病性。在鸡体内连续传代6代不返强。  

J-亚群禽白血病JL-2株的分离鉴定

近年来，J-亚群禽自血病的暴发流行在国内时有报道，在本研究中，自吉林某患病鸡群分离出一株病毒，采用特异性引物，经RT-PCR扩增出长度为545bp的J-亚群禽自血病病毒特异性核苷酸片段；将病毒经SPF鸡胚成纤维细胞增殖，获取其前病毒DNA，依据原型毒株RPRS-103 cDNA序列设计并合成一对引物，经PCR扩增得到包括gp85、gp37、E-element基因在内的近1．8kb的DNA片段，将其连到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌JM109，培养后提取质粒分别用Hind Ⅲ，BamHI进行单酶切和双酶切鉴定，得到了阳性重组质粒pMD18-T-JL2／env，核苷酸序列测定结果表明，该片段为J-亚群禽白血病病毒囊膜基因，其中亚型特异性片段gp85和标准对照毒株HPRS-103的同源率为94％，所编码氨基酸的同源率为87％。  

鸡传染性法氏囊病超强毒Gx及其致弱株基因组B节段的克隆和序列分析

用蛋白酶K法分离提取了鸡传染性法氏囊病病毒强毒株Gx及其致弱株Gt的病毒核酸dsRNA,应用随机引物将RNA反转录成cDNA,以此为模板用长距离一步法扩增出全长基因B节段,将其克隆入PMD18-T载体,进行了测序,并用DNAStar软件进行序列分析.测序结果表明,克隆的Gx株B节段全长为2 827bp,与超强毒参考株UK661的同源性为88.2%,与强毒参考株Harbin-1株的同源性达96.3%;克隆的Gt株B节段全长为2827bp,与弱毒参考株P2的同源性达99.5%.而Gx株与Gt株B节段的核苷酸的同源性只有89.8%;vvIBDV-Gx、IBDV-Gt株B节段全长的获得将为进一步构建感染性分子克隆奠定必要的基础.  

传染性法氏囊病超强毒Gx株VP5基因在病毒致弱过程中的变异研究

利用SPF鸡胚对鸡传染性法氏囊病超强毒(vvIBDV)Gx株进行培育,通过鸡胚成纤维细胞对病毒进行传代致弱,对其非结构蛋白VP5基因核苷酸及推导的氨基酸序列进行分析,从而揭示vvIBDV Gx从超强毒力向弱毒力转化过程中基因的序列变化规律.对不同代次细胞毒序列分析的结果表明,细胞毒在第8代以前,VP5基因序列没有改变,与欧洲标准超强毒氨基酸同源性达98%以上;细胞毒第9代核苷酸和氨基酸序列发生了改变;10代毒VP5基因与欧洲标准弱毒Cu-1氨基酸序列同源性达99%;细胞适应毒传至20代,其VP5基因序列不再改变.从而说明,vvIBDV Gx株VP5基因在致弱过程中存在变化规律.  

J亚群禽白血病ELISA抗体检测方法的建立

本研究分离纯化了具有反应活性的J亚群禽白血病JL-2株gp85表达蛋白,并以其为抗原,开展了相关反应条件、特异性、重复性、敏感性、现地应用以及国外试剂盒符合率等方面的研究,初步建立了J亚群禽白血病ELISA诊断方法.  

中国部分地区传染性法氏囊病病毒分子流病学调查

为调查我国鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的流行情况,从我国11个省(市、自治区)采集法氏囊病料,分离鉴定鸡传染性法氏囊病病毒20株,运用RT-PCR方法对分离株的VP2基因进行扩增、测序和序列分析.研究表明,20株分离毒株中有19株具有IBDV超强毒株的分子特征,即222A、256I、294I和299S,与我国IBDV超强毒Gx株的核苷酸同源率在96.7%～99.4%,推导氨基酸同源率在98.2%～100% 遗传进化分析表明,所有分离毒株具有共同的祖先.  

2009年我国部分地区禽白血病分子流行病学调查

为了解自2009年年初以来国内一些地区禽白血病流行情况及流行毒株的分子特征,我们从湖北、黑龙江、山东、辽宁、吉林、广东、宁夏、安徽8个省区39个鸡场采集疑似禽白血病病料样品178份,用ALV-A、ALV-B和ALV-J特异性引物,通过PCR方法进行检测.结果表明,8个省的35个鸡场的124份病料中检出了ALV-J(69.7%);25份病料中检出了ALV-A(13.9%);7份病料中检出了ALV-B(3.9%).14个分离毒株env基因氨基酸同源性为84.3%～99%;与J亚群原型毒株HPRS-103的氨基酸序列同源性为87.3%～98.2%;与其它J亚群env基因氨基酸序列同源性为83%～97.4%.遗传进化分析表明,14个ALV-J分离株分别分属于不同的分支.其中,LJL09DH02分离株与其它分离株及参考毒株的的亲缘关系最远,与HPRS-103的氨基酸同源性仅为87.3%.另外4个分离株的env基因与HPRS-103的氨基酸同源性低于93%,其余9株与HPRS-103的同源性较高(96.6%以上).该调查结果表明,我国目前ALV的感染主要以J亚群为主,ALV-A和B同时存在.  

传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP3基因的克隆与原核表达

利用PCR技术扩增出IBDV的结构蛋白VP3基因，将其克隆到表达载体pPRO^EX-HTa中，获得重组质粒命名为VP3／PA，经PCR、酶切和序列分析鉴定表明，插入的位置、大小和读码框均正确。SDS—PAGE检测表明，经重组质粒VP3／PA转化、诱导的受体菌E．coli DH5 α能表达结构蛋白VP3基因，约33 Ku，表达量达到了茵体总蛋白的33．9％，经Western blot等检测表明，诱导表达的抗原蛋白能与vvIBDV阳性血清发生特异性反应。这为IBDV血清学诊断方法的建立打下了基础。  

J亚群禽白血病JL-2株gp85基因的克隆与表达

本实验在分离鉴定J亚群禽白血病JL-2株的基础上,利用PCR方法扩增出包括gp85基因在内的长度为960bp的DNA片段.将其连到PGEX-6p-1载体上,构建了重组表达质粒PGEX-6P-1/gp85,对质粒进行序列分析并在IPTG的诱导下进行表达.SDS-PAGE分析结果表明,融合蛋白(54 Ku)在BL21中得到有效表达.表达产物占菌体总蛋白的31.8%.Western Blot结果表明,表达产物可与ALV-J阳性血清发生特异性反应.这些结果为进一步研究gp85蛋白的功能及研制ALV-J ELISA诊断试剂盒奠定了基础.