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1.
猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)Henan株的分离与全基因组序列分析   总被引:10,自引:6,他引:4  
用PCR方法从河南某猪场送检的1头疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征病猪的腹股沟淋巴结中检测到了猪Ⅱ型圆环病毒(porcine circovirus type2,PCV2)核酸。将该病料研磨、过滤除菌后接种无PCV1和PCV2污染的PK-15细胞,盲传12代后,用PCR方法仍然能够在接种细胞中检测到PCV2核酸。从接种细胞中收获病毒,经超速离心纯化后电镜负染观察.可见直径约17nm、呈二十面体对称结构的病毒粒子,表明从发病猪中分离到了PCV2,将该毒株命名为PCV2Henan株。序列分析表明:该株病毒全基因组长1767bp,包含11个读码框,与PCV1同源性为76.2%~77.3%,与其他PCV2株的同源性为95.5%~99.6%。  相似文献
2.
检测伪狂犬病病毒双抗体夹心间接ELISA方法的建立与应用   总被引:10,自引:0,他引:10  
以猪伪狂犬病病毒(PrV)Ea株特异性单克隆抗体576株为捕获抗体,纯化的抗PrV IgG为检测抗体,建立了检测PrV抗原的双抗体夹心ELISA方法。最佳反应条件为,单克隆抗体576株的包被浓度为12.2μg/mL,IgG的工作浓度为16.0μg/mL,对PrV的检测灵敏度达15.6ng(0.156μg/mL),与乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(HCV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)和猪流感病毒(SIV)等无交叉反应。批间和批内变异系数较小,分别为6.39%和4.1%。应用本方法对人工感染PrV的40日龄仔猪组织进行检测,肺和脑PrV抗原检出率最高,其次是脾、心、肝和肌肉。应用该方法和PrV对159份临床样本进行平行检测,发现二者的符合率可达到77.4%,比PCR敏感。实验结果表明:双抗体夹心间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强和重复性好的特点,可广泛应用于动物组织中PrV的检测。  相似文献
3.
猪源D型产毒素多杀性巴氏杆菌toxA基因的克隆与表达   总被引:5,自引:0,他引:5  
皮肤坏死毒素(Dermonecrotic toxin,DNT)是产毒素多杀性巴氏杆菌(Toxigenic Pasteurella multocida,T^+Pm)的主要毒力因子和保护性抗原。以猪源D型T^+Pm的基因组DNA为模板,用PCR方法扩增得到了编码DNT的toxA全基因编码序列,共4019bp。将其克隆到pMD18-T载体并测序,结果表明,toxA基因序列与GenBank已报道的5个toxA基因序列的同源性达99.8%以上。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-KG的GST基因下游,转化BL21(DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导表达,获得大小约173000的融合蛋白。Western blot结果表明,该融合蛋白具有良好的反应原性。动物试验表明,该重组蛋白可以诱导小鼠产生高水平的抗体,并可抵抗致死剂量的天然DNT毒素攻击。  相似文献
4.
为了研制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因工程疫苗,以伪狂犬病毒(PRV)gE基因缺失标志疫苗株TK^-/gE^-/LacZ^+为病毒载体,通过同源重组,构建了共表达与牛疱疹病毒1型VP22(BHV-1 VP22)融合的PRRSV E及M蛋白的重组伪狂犬病毒(rPRV)TK^-/gE^-/VP22E^+/VP22M^+。经PCR、Southern blot、Western blot证实rPRV构建正确,并能表达与BHV-1 VP22融合的PRRSV E及M蛋白。rPRV在IBRS-2、PK-15细胞中的增殖滴度与PRV亲本株相比无显著差异,表明外源基因的插入不影响rPRV增殖。用该rPRV免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠抗PRRSV中和抗体及脾淋巴细胞增殖反应,并与未融合VP22的单表达PRRSV E蛋白及共表达E及M蛋白的rPRV TK^-/gE^-/E^+与TK^-/gE^-/E^+/M^+进行比较。结果显示TK^-/gE^-/VP22E^+/VP22M^+可诱导小鼠产生更好的体液与细胞免疫反应,BHV-1 VP22发挥了佐剂效应。本研究为研制安全、有效的猪繁殖与呼吸综合征-伪狂犬病二价基因工程疫苗奠定了基础。  相似文献
5.
伪狂犬病病毒PK基因的克隆与PK、gG双缺失转移载体的构建   总被引:3,自引:3,他引:0  
地高辛标记伪狂犬病病毒(PRV)Ea株短区段蛋白激酶(PK)基因3′端0.4kb片段,Southern杂交确定短区段PK基因定位在基因组DNA BamH Ⅰ 4.0kb片段中。将该片段克隆获得重组质粒pSB304,对pSB304亚克隆,构建了仅含完整PK基因约1.3kb片段的重组质粒pSB305,并进行了序列测定。结果表明,PK基因存在2种可能的同框编码方式,分别编码388或334个氨基酸残基,并具有真核细胞蛋白激酶催化结构域序列。同国外PRV NIA-3、Ka株相比,氨基酸同源性分别为98.8%和97.3%,有意义的是Ea株、Ka株均较NIA-3株在同一位置缺失2个氨基酸(Asp,Gly)。进一步对pSB305和含gG全基因以及部分gD基因的质粒pUSK进行酶切拼接,将PK基因大部分编码区、gG基因5′端部分编码区进行缺失,构建成两端同源侧翼分别为3.1kb和1.6kb的PK、gG双缺失转移载体pLR001。上述结果为深入研究PK基因功能及研制更安全的TK^-/PK^-/gG^-三缺失基因工程疫苗奠定了基础。  相似文献
6.
三种不同方法检测猪伪狂犬病毒血清抗体的比较   总被引:2,自引:2,他引:3  
7.
猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究   总被引:2,自引:2,他引:16  
用PCR方法配合生化鉴定,从有肺炎症状猪的肺脏及进行性萎缩性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis,PAR)症状猪的鼻拭子中分离出66株多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)。然后做了药敏试验,并用PCR方法对这66株Pm进行分型及毒素基因的检测,用豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对产毒素多杀性巴氏杆菌(Toxigenie Pasteurella multocida,T^ Pm)进一步鉴定。结果显示PCR鉴定与生化鉴定Pm结果完全一致;PCR分型表明有46株为D型Pm,18株为A型:Pm,1株为B型Pm,1株无法定型;有8株用PcR检测为T^ Pm;豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对这8株T^ Pm的进一步鉴定也表明均为产毒素菌株。所鉴定的8株T^ Pm都为D型,都分离于有严重PAR症状的猪。  相似文献
8.
我国亟待加强奶牛重大疫病预警体系建设   总被引:2,自引:0,他引:2  
我国奶牛业近年来的飞速发展给奶牛疫病防治带来巨大压力。虽然我国已初步建成了动物疫病的监测与预警系统,但尚不能满足疫情的实时测报和预警的实际需求。需要从支撑技术、网络建设、信息系统等各方面加强我国奶牛重大疫病的检测与预警体系建设,以保证奶业可持续发展和人民健康。  相似文献
9.
对以伪狂犬病病毒鄂A株为亲本毒株构建的TK和gG双基因缺失突变株(PrV HB-98株)的增殖能力、安全性、毒力稳定性和免疫原性进行了测定。结果表明,PrV HB-98株在BHK-21细胞上的增殖滴度为10^7.0 TCID50/0.1mL以上,与亲本毒株相当,但高于Bartha株;与PrV鄂A株相比,病毒量为10^7.0TCID50的PrV HB-98株不引起BALB/c小鼠的死亡,毒力也低于Bartha株;将PrV HB-98株在PK-15细胞连续培养25代和在猪体内上连续继代5次,各代次突变株TK基因和LacZ基因能被稳定扩增,未出现毒力回复现象.表明该毒株具有良好的遗传稳定性;以10^5.0、10^6.0、10^7.0TCID50等3个不同剂量的PrV HB-98株接种于妊娠50~60d母猪和1日龄仔猪,母猪均能正常产仔.仔猪也未出现任何临床症状,证明该毒株有较好的安全性。另外,以10^5.0TCID50的PrV HB-98株接种于妊娠50~60d母猪和1日龄仔猪,分别于接种后28d和20d,用10^7.0TCID50 PrV鄂A强毒进行攻击.结果免疫猪都能抵抗强毒的攻击.获得保护,表明该毒株具有很强的免疫原性。综合上述结果表明,PrV HB-98株可以作为候选毒株.用于伪狂犬病基因工程疫苗的研制。  相似文献
10.
中国部分地区猪圆环病毒2型的基因型分析   总被引:1,自引:1,他引:5  
对中国11个省(市)部分猪场收集的812份病料,应用ORF2-PCR进行检测,发现有235份为PCV2阳性病料.利用鉴别PCR方法从235份阳性病料中,检出10份PCV2a基因型和133份PCV2b基因型,检出率分别为4.2%、56.6%.进一步对ORF2-PCR检测阳性的部分模板进行全基因组扩增,构建阳性重组质粒,对插入质粒的片段进行测序鉴定,利用DNAStar进行同源性分析,同GenBank参考毒株绘制系统发育树,从系统发育树中也可分出PCV2a、PCV2b 2种基因型.鉴别PCR和测序结果说明,我国部分地区流行的猪圆环病毒2型以PCV2b基因型为主,少数为PCV2a基因型,也有既非PCV2a又非PCV2b的基因型(PCV2c?).  相似文献
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