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1.
猪α干扰素/白细胞介素2基因的融合表达及活性研究   总被引:1,自引:1,他引:4  
为了研究高效广谱的猪基因工程抗病毒制剂,作者采用重叠延伸PCR(Splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头(linker)(G4S)3将猪α干扰素(Porcine interferon alpha,PoIFN-α)与猪白细胞介素2(Porcine interleukin-2,PoIL-2)成熟肽基因连接,构建成PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因,并克隆入pGEM-T Easy载体,将PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体进行原核表达.通过尿素变性、复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rPoIFN-α-linker-PoIL-2)进行纯化.采用细胞病变抑制法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白中的PoIFN-α在不同细胞系上对不同病毒增殖活性的抑制作用;分别采用MTT法和PoIL-2 ELISA试验方法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白中PoIL-2的生物学活性.结果表明成功构建并克隆PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因.嵌合基因在大肠杆菌中得到高效表达,表达的rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白相对分子质量约36.7 ku,蛋白经纯化后纯度在96%以上.rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白在细胞上具有与单一rPoIFN-α蛋白相近的抑制病毒增殖活性,其中在PK-15细胞上抗VSV的活性单位为1.891×104 IU·mL-1,在Marc-145细胞上抑制高致病性PRRSV增殖的活性单位为905 U·mL-1;rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白具有与单一rPoIL-2蛋白对照相近的生物学活性,可明显促进CTLL-2细胞的增殖,并可与抗PoIL-2单抗发生特异性免疫反应.这表明rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白具有rPoIFN-α和rPoIL-2蛋白双重的生物学活性,为基因工程抗病毒制剂的开发以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征等病毒性疾病的预防和治疗等研究奠定了基础.  相似文献
2.
以纯化的原核表达的猪圆环病毒2型(PCV-2)重组结构蛋白(rCap蛋白)为包被抗原,建立PCV-2间接ELISA诊断方法;对抗原最适包被浓度、待检血清稀释浓度、重组抗原包被条件、封闭液的筛选、阴阳性临界值等条件进行了优化;对优化后的ELISA检测方法进行特异性试验、临床应用试验;组装试剂盒并进行试剂盒保存期试验。优化反应条件后确定的抗原最适包被浓度为2.815 μg/mL,抗原最佳包被条件为37 ℃ 2 h;血清最适稀释度为1∶40,酶标抗体最适稀释度为1∶500,最佳封闭液为1% BSA;阴阳性临界值判定标准为D450 nm≥0.33,判为阳性,D450 nm<0.33,判为阴性。特异性试验结果表明,只有PCV-2阳性血清反应后的D450 nm>0.33,包括抗PCV-1阳性血清在内的其他5种抗血清反应后的D450 nm<0.33,说明所建立的ELISA方法具有良好的特异性。经对临床疑似PCV-2感染的100份血清样品进行检测,阳性检出率为69%。组装试剂盒在4 ℃条件下至少可保存12个月以上,说明所建立的诊断方法可以在生产中大量推广应用。本研究成功建立了能特异性检测抗PCV-2血清抗体的ELISA检测方法。  相似文献
3.
猪白细胞介素-6的原核表达及其生物学活性研究   总被引:1,自引:1,他引:0       下载免费PDF全文
本研究采用RT-PCR方法自细菌脂多糖(LPS)刺激的猪脾脏细胞总RNA中扩增、克隆猪白介素-6(porcine interleukin-6,PoIL-6)成熟肽基因,并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的重组融合猪白介素-6(rPoIL-6)蛋白通过尿素变性、低浓度复性液复性、PBS透析等步骤进行复性、纯化,采用PoIL-6 ELISA试剂盒检测rPoIL-6蛋白与抗PoIL-6单抗发生特异性免疫反应的活性;采用MTS法检测rPoIL-6蛋白促猪脾脏细胞的增殖活性。结果表明,成功克隆了全长555 bp的PoIL-6成熟肽基因;表达的rPoIL-6蛋白分子质量大小约20 ku;纯化后的rPoIL-6蛋白纯度在95%以上,可和抗PoIL-6单抗发生特异性免疫反应,并且具有显著促猪脾脏细胞增殖活性。  相似文献
4.
猪瘟是一种传染性极强的病毒性疾病.可感染各年龄段的猪只,一年四季流行,发病率和死亡率均很高,危害极大。笔者通过对许昌及周围几个县市的几十个猪场进行调查研究.根据猪瘟流行和发病特点分析其发病原因,并总结出相应的综合防治对策,供广大养殖户参考。  相似文献
5.
本研究采用RT-PCR方法自刀豆素(Con A)刺激的猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增克隆了猪白细胞介素-2(porcine interleutin-2,PoIL-2)成熟肽基因,并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的融合重组猪白细胞介素-2(rPoIL-2)蛋白通过尿素变性、低浓度复性液复性、PBS溶液透析等步骤进行纯化,采用MTT法测定rPoIL-2蛋白促小鼠细胞毒性淋巴样系CTLL-2株细胞增殖活性以评价rPoIL-2的活性。结果表明,成功克隆了rPoIL-2的成熟肽基因,基因全长405 bp,编码134个氨基酸;表达的rPoIFN-α蛋白分子质量大小约为16.5 ku,与预期大小相一致;经纯化后的蛋白质纯度在96%以上;纯化的rPoIL-2蛋白促小鼠CTLL-2株细胞增殖活性最高值是对照细胞的3倍。本研究成功表达了具有生物学活性的PoIL-2蛋白,为新型基因工程抗病毒制剂和免疫增强剂的开发奠定了基础。  相似文献
6.
2009年6月,河南省许昌某猪场出现猪圆环病毒2型和猪链球菌混合感染的疑似病例,临床主要表现为体温升高、呼吸困难、体表瘀血等症状;剖检变化为淋巴结水肿、脑膜炎和关节炎、急性炎性脾肿等。笔者通过对其临床症状、剖检变化和实验室检测结果进行综合分析,确诊为猪圆环病毒2型和猪链球菌的混合感染。笔者对防制措施也进行了初步阐述,希望为今后该类疾病感染的诊断与治疗提供借鉴。  相似文献
7.
1生物学特性 谷稗为禾本科稗属1年生草本植物,株高达1.9~2.5米,茎直立粗壮,叶片长而宽厚,颜色为墨绿或黄绿色。须根发达,平均有效分蘖6—8个,圆锥花序大而紧凑,直立或微弯,绿色,每亩(667平方米)产鲜草4000千克以上,秸草1000千克以上,籽实300千克以上,是草、料兼收的饲料饲草作物。土质较好地块,株高2.3~2.5米,最大单株成穗达24个,单株鲜重2.5千克,亩产秸草2000千克,籽实350千克以上。  相似文献
8.
弓形虫病是一种人兽共患疾病,广泛分布于世界各地,对人及家畜的危害非常严重.人的先天性弓形虫病在胎儿或婴幼儿可出现发育畸形、智力障碍、脑炎、脑膜炎甚至死亡等临床症状;许多畜禽如猪、牛、猫、犬、羊、马、骆驼、家兔、鸡、鸭等都可以感染弓形虫且出现病症,其中以猪的感染率较高,该病曾给养猪生产造成巨大经济损失.为此,主要就猪弓形虫病的临床症状、病理变化及实验室诊断方法等方面作一简要概述.  相似文献
9.
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)又称“猪蓝耳病”.是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍和各阶段猪呼吸道疾病为特征的一种高度传染性疫病。该病于1987年首次发现于美国.之后在北美、欧洲以及亚洲广泛流行,波及全球各养猪业国家。由于该病的复杂性.尤其是猪群感染PRRSV后对其他致病因子的易感性增加,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。  相似文献
10.
小反刍兽疫是一种主要感染小反刍动物的急性、接触性疫病,对养殖业危害巨大。该病没有有效治疗方法,只能预防,因此诊断监测技术是控制该病的重要手段。传统的血清学诊断技术如病毒中和试验(VNT))等存在诸多缺陷,难以用于大规模的疫情监控。目前国际上应用于该病快速诊断的新技术主要有ELISA、RT—PCR、荧光定量RT—PCR、PCR—ELISA等,这些新技术灵敏、便捷、高通量,而且能够在野外进行。现将这些诊断技术的研究进展作一综述。  相似文献
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