斑马鱼性腺组织的原代细胞培养技术的建立

[目的]建立斑马鱼卵巢和精巢组织的原代细胞培养技术,获得原代和传代培养细胞单层。[方法]采用组织块贴壁法进行斑马鱼卵巢和精巢组织的原代细胞培养,采用0.25%胰蛋白酶消化法进行传代培养。[结果]斑马鱼性腺组织的原代细胞培养条件为:最适培养基为DMEM/F12(p H 7.0~7.2),培养温度为24℃,在添加20 ng/m L表皮生长因子(EGF)、20 ng/m L碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)、0.5 mmol/Lβ-巯基乙醇和15%胎牛血清时更有利于细胞的存活。其中,卵巢的组织块接种3~4 d后,上皮样细胞首先开始迁出,迁出的上皮样细胞生长5 d后,逐渐凋亡;此后,成纤维样细胞和另一种上皮样细胞开始大量迁出,10 d后可生长汇合成80%的原代细胞单层;可成功传代培养1次,但传代后的上皮样细胞不贴壁,很快死亡,而传代后的成纤维样细胞可贴壁生长,但基本不分裂,健康存活7 d后开始逐渐凋亡。精巢组织接种5 d后,上皮样细胞和成纤维样细胞同时开始迁出,培养16 d后逐渐凋亡,仅得到60%原代培养细胞单层。[结论]初步建立了斑马鱼性腺组织的原代细胞培养条件,并将卵巢组织块迁出的成纤维样细胞成功传代1次。     

滋阴清热降糖丸HPLC指纹图谱的建立及多成分含量测定

建立滋阴清热降糖丸HPLC指纹图谱,并对多种成分进行含量测定。色谱柱为Agilent 5 HC-C₁₈(250.0 mm×4.6 mm, 5μm);流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液,梯度洗脱,流速为1.0 mL/min,采用PDA检测器在190～400 nm处进行全波长扫描,提取最大波长色谱图。对10批样品进行HPLC分析,采用“中药色谱指纹图谱相似度评价”生成指纹图谱,并对样品中多种成分进行含量测定。试验成功建立了滋阴清热降糖丸HPLC指纹图谱,确定共有峰,同时对9种成分进行含量测定,方法学考察符合要求。本研究建立的HPLC指纹图谱和含量测定方法操作简便,测定成分全面,重复性好,可为滋阴清热降糖丸质量标准的修订提供参考。     

甜瓜蒂质量标准完善研究

完善甜瓜蒂质量标准并提高。采用薄层色谱法对甜瓜蒂进行定性鉴别,并采用高效液相色谱法测定葫芦素B的含量,色谱条件:Agilent HC-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),乙腈-0.1%磷酸溶液(60∶40)为流动相,流速为1.0 mL/min;检测波长为228 nm。结果表明,薄层色谱斑点清晰,分离度好,专属性强,重复性良好;高效液相色谱法测定葫芦素B的回归方程为:Y=1 367 962.09X+465.59,r=0.999 6,在0.0340~4.247 0 mg/mL线性关系良好;平均回收率为98.4%,RSD为1.6%。说明该研究建立的薄层色谱鉴别和高效液相色谱含量测定方法简便、快捷、结果准确、可靠,为甜瓜蒂质量标准的修订完善提供了可靠依据。     

中国家蚕抗菌肽基因的PCR扩增,克隆和序列测定

本实验采用ＰＣＲ技术，扩增中国家蚕抗菌肽ｃｅｃｒｏｐｉｎＢ基因片段，并以ＰＵＣ１９质粒为载体，将该基因片段转化到大肠杆菌中。从筛选得到的阳性克隆中分离出ｃｅｃｒｏｐｉｎＢ基因，测定其序列，并由此推导出氨基酸序列。结果表明：（１）抗菌肽ｃｅｃｒｏｐｉｎＢ基因片段长为８６６ｂｐ，包括７３ｂｐ的ＥｘｏｎＩ，５５６ｂｐ的Ｉｎｔｒｏｎ，８７ｂｐ的ＥｘｏｎⅡ和１５０ｂｐ的３’端非编码区。其中，非内含子部分的碱基序列与已克隆的日本家蚕的两个ｃｅｒｏｐｉｎＢｃＤＮＡ序列比较，同源性分别为８７．５％和９５％；（２）推导出的成熟抗菌肽由３７个氨基酸残基组成，其氨基酸序列与日本家蚕和天蚕的氨基酸序列相比较，同源性为９１．９％和８０．６％。     

三仙脱力丹质量标准研究

目的:建立三仙脱力丹的质量标准。方法:采用薄层色谱法对三仙脱力丹组方中药材五味子、淫羊藿进行定性鉴别;采用高效液相色谱法测定淫羊藿苷的含量,色谱柱为InertSil ODS-SP C_(18)色谱柱(5μm,4.6 mm×250 mm),流动相为乙腈-水(30∶70),流速1.0 mL/min,柱温30℃,检测波长270 nm。结果:薄层色谱鉴别斑点清晰,专属性强,阴性对照无干扰;高效液相色谱法测定淫羊藿苷在0.209 6～1.048 0μg呈良好的线性关系(r=0.999 8),加样回收率为99.43%,RSD为1.84%(n=5)。结论:本研究建立的检测方法既能定性又能定量,操作方法简便,专属性强,重复性好,可作为制剂三仙脱力丹的质量标准。     

刀额新对虾原代淋巴细胞培养及其感染白斑综合征病毒（WSSV）的病理特征

为深入了解对虾白斑综合征病毒(WSSV)的致病机理和体外培养的对虾细胞对WSSV的敏感性,实验以1.5×L-15培养基培养刀额新对虾原代淋巴细胞,待细胞形成单层后接种WSSV,通过倒置显微镜、荧光显微镜、透射电子显微镜观察接种病毒后细胞的病理变化。结果显示,使用1.5×L-15培养基培养对虾淋巴组织,3 h后可观察到有细胞迁出,并能迅速形成单层,36 h后细胞的迁出汇合率可达80%,且能存活20 d以上。接种WSSV 24 h后,出现病变的细胞变圆、漂浮,细胞之间的网状结构消失,最后细胞破碎、溶解;接种WSSV 48 h后Hoechst 33342染色结果显示,感染的细胞核深染,且变形、膨大;电镜下,细胞核内含大量成簇分布的杆状病毒,细胞器被挤向细胞边缘,细胞膜轮廓模糊。研究表明,纯化的病毒粒子接种体外培养的淋巴细胞,能够使其产生明显病理变化,证明了WSSV对体外培养的淋巴细胞具有感染力,并且可在淋巴细胞中增殖。     

两种中药制剂微生物限度检查方法验证

建立滋阴清热降糖丸、金水咳喘康胶囊的微生物限度检查方法,并对其进行验证。取滋阴清热降糖丸、金水咳喘康胶囊各10 g,用TSB制成1∶10的供试液,混匀,采用平皿法进行检查,需氧菌采用1∶50、1∶100、1∶1 000 3个稀释度,霉菌、酵母菌采用1∶10、1∶100 2个稀释度,加入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉,测定回收率。控制菌按照《中华人民共和国药典》2020年版四部中规定检查大肠埃希菌、沙门菌、耐胆盐革兰阴性菌。按上述方法进行验证,测定菌种回收率均为0.5～2.0,方法适用性试验结果满足要求。说明平皿法经验证有效,可用于这两种中药制剂的微生物限度检查,能有效控制药品质量,结果准确可靠。     

中药饮片金银花微生物污染状况考察

对河北、安徽及四川3省10家不同企业、不同环节的20批中药饮片金银花进行检测，全面考察微生物污染程度。按照《中华人民共和国药典》2020年版(四部)通则1108中药饮片微生物限度检查法，对20批中药饮片金银花采用常规平皿法(倾注法)进行需氧菌总数(TAMC)、酵母和霉菌总数(TYMC)、耐热菌总数、耐胆盐革兰阴性菌及沙门菌检测，参照其他国家药典增加金黄色葡萄球菌和洋葱伯克霍尔德菌的检验，统计微生物限度污染情况。结果显示，饮片中TAMC与耐热菌和耐胆盐革兰阴性菌呈正相关系；5批样品检出霉菌，在种植和加工环节尤为突出；15%的饮片耐胆盐革兰阴性菌N>10³;50%的饮片检出大肠埃希菌；沙门菌、金黄色葡萄球菌及洋葱伯克霍尔德菌均未检出。从考察结果看，亟需完善国内中药饮片分类体系，建立适合国内中药饮片的培养体系和标准，从而加强中药饮片种植和加工环节微生物污染的管控。