基因组选择技术在半滑舌鳎“鳎优1号”新品种培育中的应用研究

半滑舌鳎是我国九大海水养殖鱼类之一,入选国家海水鱼产业技术体系。因其肉质细腻、味道鲜美,极受消费者欢迎,市场价值很高。在半滑舌鳎养殖业蓬勃发展过程中,种质退化、抗病力下降和疾病频发等问题相继出现,制约了养殖产业的发展。为改善半滑舌鳎种质资源现状,我们针对生长和抗病性状开展了连续四代家系选育,并从第三代选育开始,利用基因组选择育种技术估算半滑舌鳎抗哈维氏弧菌的基因组估计育种值,提高抗病性状的选育效率,于2018年分别筛选出一批生长速度快、抗病力强的家系。随后,利用这些抗病速生家系进行大规模苗种繁育,并在山东、河北和天津等地进行了连续两年的生产性对比试验。2021年,半滑舌鳎速生抗病新品种通过了全国水产原种和良种审定委员会的审定,命名为“鳎优1号”。与未经选育的半滑舌鳎相比,“鳎优1号”新品种抗哈维氏弧菌感染能力提高30.9%,18月龄鱼的体重平均提高17.7%,养殖成活率平均提高15.7%。此外,“鳎优1号”苗种的生理雌鱼比例高达40%左右。半滑舌鳎新品种“鳎优1号”的成功培育为水产养殖种业增添了良种,推动了半滑舌鳎分子育种技术的发展,为基因组选择育种技术在水产良种培育中的应用奠定了基础。     

半滑舌鳎CD40基因克隆及其免疫功能分析

本研究通过RACE技术在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)中克隆得到1个CD40同源基因。该基因c DNA全长为2098 bp,开放阅读框为1011 bp,可编码由336个氨基酸组成的蛋白质。推导得到的CD40氨基酸序列包含1个信号肽、1个跨膜结构区、2个N-糖基化位点以及含4个富含半胱氨酸的保守结构区。不同物种氨基酸序列同源分析结果显示,该基因与哺乳类、两栖类以及硬骨鱼类相似性为28%~47%,其中与硬骨鱼类相似性较高。系统进化分析结果显示,半滑舌鳎CD40与其他硬骨鱼类CD40聚类为一支,哺乳类与两栖类CD40聚类为另一支。荧光定量PCR结果显示,CD40在健康半滑舌鳎不同组织中均有表达,其中在鳃、肝和脾等组织中表达量较高,在肠、肌肉和皮肤中表达量较低,在脑和肾中微量表达。经哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染刺激后,与PBS处理的对照组相比,该基因m RNA在半滑舌鳎3个主要免疫组织(肝、脾和肾)中表达量均呈显著性升高,在肝中12 h到达峰值,在脾和肾中6 h达到峰值。上述结果表明CD40基因参与了半滑舌鳎抵抗哈维氏弧菌的免疫应答反应。     

牙鲆抗迟缓爱德华氏菌性状的遗传力和育种值分析

由于高密度工厂化养殖、海水污染等原因,牙鲆(Paralichthys olivaceus)养殖产业面临前所未有的危机,本研究以历年培育的抗病、速生牙鲆为亲本于2015年建立了57个家系,包括11个F3代和46个F4代家系.选择其中46个家系在146日龄和164日龄分别进行迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染实验,配对样本t检验表明,两次实验无显著差异(P＞0.05).感染后的存活率分析表明,不同家系在抗迟缓爱德华氏菌的能力上存在显著差异(P＜0.05),从中鉴定出抗病力强的家系5个(F1551,F1503,F1501,F1550和F1505),其存活率均大于70％.根据46个家系的日增重率确定了4个快速生长家系(F1533,F1551,F1514和F1502),日增重率均大于0.225 0g/d.2015年牙鲆抗迟缓爱德华氏菌的抗病遗传力为0.177士0.020,为低遗传力,抗病性状选育适合家系选育.亲本抗病育种值变化范围为(-1.962士0.646)～(2.110±0.546),父母本育种值均较高的家系为F1551、F1550、F1501和F1505,其中,存活率最高的F1551家系的父母本育种值是所有家系父母本中最高的,表明具有良好抗病性能的F1551家系的父母本具有很好的育种性能.本研究通过家系选育、细菌感染实验及遗传参数和育种值分析,筛选出了抗病性强、生长速度快及父母本育种值高的家系,为培育抗病、生长快速牙鲆新品种提供了理论支持.     

几株芽孢杆菌的生理生化、生长和产酶特性研究

本研究对几株芽孢杆菌进行了7%氯化钠生长、V-P测定、硝酸盐还原、D-甘露醇发酵、丙酸盐利用等指标的测定,并设置了15℃和28℃两个温度,对其生长性能进行比较,最后采用平板水解圈法对其产蛋白酶和淀粉酶能力进行了比较。结果表明:解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的生理生化指标非常相近,通过简单的生理生化指标难以区分。15℃时,解淀粉、枯草和地衣三类芽孢均在24 h后进入对数生长期,地衣芽孢杆菌生长最差;28℃时,4 h内即进入对数生长期,地衣芽孢杆菌生长明显好于15℃时。产蛋白酶和淀粉酶方面,解淀粉芽孢杆菌能力最强,枯草和地衣芽孢杆菌之间差异不大,均比解淀粉稍逊一筹。     

抗迟缓爱德华氏菌病牙鲆家系的筛选与分析

牙鲆(Paralichthys olivaceus)养殖病害日益严重,迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是牙鲆养殖中的主要致病菌,带来了极大的经济损失,为了培育出对该病抵抗能力强的牙鲆新品种,2014年4–6月间,利用我们长期以来建立和筛选出来的牙鲆抗病群体和家系的亲鱼,通过杂交,自交,雌核发育建立47个家系,9–10月间,对其中39个家系进行感染实验,先用少量鱼进行预实验摸索出半致死浓度,然后再进行正式感染实验,感染数量为每个家系80尾。各家系的存活率范围为1.19%~51.19%,最终平均存活率为20.29%,认为存活率高于30%的7个家系为抗病力强家系,存活率在20.29%~30%的9个家系为抗病力一般家系,平均存活率以下的23个家系为抗病力弱家系。1406#家系抗病力最强,它为1005#家系的自交后代,而其他抗病力强家系也大多是1005#、09104#、0915#的后代。而09104#为0768#的后代,并且0768#抗鳗弧菌病能力强。1005#为韩国群体自交后代,0915#为韩国群体和日本群体杂交后代。这些抗病力强的牙鲆可以作为新品系进行推广养殖,可望减少牙鲆腹水病发生。     

半滑舌鳎trim36基因cDNA克隆及表达分析

三重基序蛋白(the tripartite motif-containing protein,TRIM)家族是一类结构保守、进化快速的E3泛素蛋白连接酶,参与诸多重要的生命过程.TRIM36是TRIM家族的一员,trim36编码E3泛素蛋白连接酶.本研究在已完成的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)全基因组测序及转录组测序的基础上,利用RACE技术克隆得到半滑舌鳎trim36基因(GenBank登录号:KU244470),序列全长为2 899 bp,其中ORF为2 214 bp,编码737个氨基酸,5’非翻译区(untranslated regions,UTR)为289 bp,3'UTR为396 bp.生物信息学分析显示,半滑舌鳎TRIM36蛋白包含1个锌指结构,2个B-BOX类型锌指蛋白结构域(B-Box-typezinc finger,BBOX),1个卷曲螺旋结构,1个羧基末端的纤连蛋白Ⅲ(fibronectin typeⅢ,FN3)结构域和1个双特异性蛋白激酶spla和兰尼碱受体(spla kinase and ryanodine receptor,SPRY)结构域.此外,在不同脊椎动物中,trim36基因与其邻近的基因具有保守的共线性关系.半定量RT-PCR及qRT-PCR结果显示,在半滑舌鳎不同组织中,trim36基因表达存在差异.trim36在卵巢中表达量最高,其次为雌、雄鱼的脑中;不同发育时期中,trim36基因在120日龄半滑舌鳎性腺中开始表达,且卵巢表达量显著高于精巢(P＜0.05).原位杂交结果显示,trim36基因杂交信号主要出现在Ⅰ期和Ⅱ期卵母细胞.trim36时空表达特征表明,其在卵巢腔的形成及Ⅰ期、Ⅱ期卵母细胞的形成中起重要作用.结果表明,trim36在性别发生方面有一定的作用,这为进一步研究鱼类ttim36基因功能及TRIM家族基因功能提供线索和参考.     

大菱鲆MKK基因家族全基因组鉴定及其在生物和非生物应激下的表达分析

为了阐明大菱鲆丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinases,MAPKKs或MKKs)基因家族在生物和非生物应激响应中的作用，本实验首先通过生物信息学方法对大菱鲆MKK基因家族进行了全基因组水平的鉴定，利用多个应激相关转录组数据集分析了大菱鲆MKK家族成员在不同组织及不同生物和非生物应激下的表达模式。结果显示，本研究在大菱鲆全基因组水平上共鉴定出9个MKK基因家族成员，它们不均匀地分布在7条染色体上，并分别对其编码蛋白的理化性质、蛋白二级结构和亚细胞定位进行了预测。基于系统发育分析，将SmMKKs划分为5个亚家族。内含-外显子结构、保守基序和多重序列比对分析结果不仅为大菱鲆MKK亚家族分类提供了证据，而且表明SmMKKs在进化上高度保守。SmMKKs在不同组织及不同生物和非生物应激下的基因表达模式分析表明，SmMKKs具有明显的组织特异性表达。另外，结果显示，粘孢子虫和肿大细胞病毒感染后，SmMKK6a呈极显著差异表达；热应激处理后，SmMKK6a呈极显著差异表达；高盐或低盐胁迫后，SmMKK4a、SmMKK4b、SmMKK6a...     

牙鲆rnd1基因克隆、表达模式及与抗病力的关系

迟缓爱德华氏菌病是海水鲆鲽鱼类的主要病害，发掘抗病分子标记辅助育种是十分有效的策略。本研究以牙鲆(Paralichthys olivaceus) rnd1基因(Pornd1)为对象，对该基因在牙鲆抗病免疫方面的作用进行系统分析。首先对Pornd1基因进行克隆鉴定和抗病相关单核苷酸多态性位点的定位，然后利用荧光定量PCR (qRT-PCR)对Pornd1基因的组织分布、细菌感染后表达情况以及在抗病和易感家系中的表达水平进行检测。结果显示，Pornd1 cDNA开放阅读框为699 bp，编码232个氨基酸。结合前期GWAS分析数据，本研究对Pornd1基因扩增和测序，确定Pornd1基因内含子2上存在一个抗迟缓爱德华氏菌病相关单核苷酸多态性位点，该位点在易感家系和抗病家系中分别是C/T，抗病家系(freqT=0.92)高于易感家系(freqT=0.20)，具有显著性差异(P<0.05)。Pornd1在心、肝和肾中的相对表达量较高；迟缓爱德华氏菌感染后肝、肾和脾中Pornd1的表达量在6 h降低后逐渐升高，在48 h达到最高。Pornd1在抗病家系肝脏中的表达量显著高于易感家系。在蛋白水平，利用大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统表达PoRnd1重组蛋白，检测其抑菌活性，发现PoRnd1重组蛋白对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)均具有一定抑菌活性。本研究揭示了Pornd1在牙鲆免疫抗病方面的作用，为开展牙鲆抗病分子育种提供了一个有效标记，并为解析其抗病性状的遗传机制提供理论基础。