家蚕组织蛋白酶O(BmCatO)基因鉴定及表达分析

【目的】克隆家蚕(Bombyx mori)蛋白酶O基因Cathepsin O(Bm Cat O),分析其m RNA表达特征,通过原核表达、蛋白纯化和多次免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,为进一步探究组织蛋白酶O在家蚕变态发育中的功能奠定基础。【方法】利用RACE技术克隆获得家蚕组织蛋白酶O的全长c DNA序列,然后采用RT-PCR对其时空表达特征进行研究。从NCBI下载其他物种组织蛋白酶O基因序列,利用Clustalx和MEGA 6.0软件进行同源比对和进化分析。选取特异性较高的片段设计特异性引物,将PCR扩增产物连接至PET32a质粒,转化至E.coil表达菌株Rosetta(DE3),经IPTG诱导获得组织蛋白酶O重组蛋白,然后利用Ni+亲和层析方法对重组蛋白进行纯化,最后多次免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。【结果】家蚕组织蛋白酶O基因存在于家蚕第14号染色体上,scaffold为nscaf2943,基因编号BGIBMGA009231。该基因有两种剪切形式,剪切体1开放阅读框(ORF)全长为1 071 bp,编码356个氨基酸,预测蛋白分子量36 k D,等电点8.594;剪切体2 ORF全长为942 bp,编码313个氨基酸,预测蛋白分子量40 k D,等电点7.951。两种剪切体均有6个外显子和5个内含子构成,剪切体2的第六外显子出现部分缺失。两种剪切体编码的蛋白结构相似,均含有信号肽、Inhibitor129和Pept-C1结构域。进化分析结果表明,无脊椎动物组织蛋白酶单独聚为一类,且家蚕组织蛋白酶O与同为鳞翅目成员的二化螟(Chilo suppressalis)组织蛋白酶O最为接近。RT-PCR结果显示该基因特异性持续表达于幼虫血细胞,剪切体1的表达水平明显高于剪切体2,但这两种剪切体在幼虫血细胞发育时期表达趋势一致。构建家蚕组织蛋白酶O原核表达系统,利用亲和层析纯化获得高纯度的家蚕组织蛋白酶O重组蛋白,并利用纯蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA显示其效价高达到1﹕1 280 000。Western印迹结果表明,该抗血清可以特异性识别家蚕组织蛋白酶O重组蛋白。【结论】获得了家蚕组织蛋白酶O基因的完整c DNA序列及表达特征,经原核表达、纯化获得高纯度的融合蛋白,通过多次免疫新西兰大白兔成功获得抗体。     

园林绿地刺吸害虫及其天敌时序动态及发生规律的研究

为有效保护园林绿地中的自然天敌,以园林植物刺吸害虫及其天敌为调查对象,采用黄板诱集法,研究了园林绿地刺吸害虫及其天敌时序动态及发生规律。结果表明:绿地中京枫多态毛蚜(Periphyllus diacerivorus)、栾多态毛蚜(P.koelreuteria)、居松长足大蚜(Cinara pinihabitans)和白皮松长足大蚜(C.bungeanae)的发生期早于桃粉大尾蚜(Hyalopterus arundimis),且5种蚜虫种群均在夏季高温和天敌共同作用下崩溃;瓢虫和寄生蜂类天敌对碧桃(Pruns perscial f.duplex)上桃粉大尾蚜及捕食螨对碧桃上山楂叶螨(Tetranychus viennensis)的跟随效应明显,而天敌对其它4种植物上蚜虫无明显跟随效应;施药虽可暂时降低阔叶植物上3种蚜虫的种群数量,却大量杀伤了害虫的天敌,停药后3种蚜虫仍爆发成灾,同时使6月后碧桃上山楂叶螨种群爆发和5月中旬后油松(Pinus tabuliformis)上针叶小爪螨(Oligonychus ununguis)种群数量较多。绿地中瓢虫、草蛉、食蚜蝇和寄生蜂类天敌的发生最高峰均位于5月下旬至6月下旬,除草蛉外,绿地中的瓢虫、食蚜蝇和寄生蜂类天敌在7—8月种群数量均极低。草蛉喜欢在五角枫(Acer mono)上栖息或搜寻寄主。     

信息化手段在农村经济管理中的应用初探

本文立足于农村经济发展现状,挖掘生产力水平、基础设施建设、人才与资金等方面存在的问题,并提出针对性的解决对策,力求通过加强政府的关注度、完善网络基础设施建设、注重信息人才的引进与培训等方式,推动农村经济管理朝着信息化、智能化方向发展。     

家蚕组织蛋白酶L(BmCathepsin L)基因鉴定、表达及其功能分析

【目的】鉴定克隆家蚕组织蛋白酶L基因BmCathepsin L(BmCat L),分析其序列和表达特征。分析家蚕组织蛋白酶L在大肠杆菌诱导下m RNA表达量的变化趋势,为进一步研究家蚕组织蛋白酶L的功能打下基础。【方法】基于家蚕基因组数据库(Silk DB)中序列BGIBMGA006893设计引物,利用RACE技术克隆家蚕组织蛋白酶L基因的cDNA全长序列,通过在线工具对基因结构和蛋白质分子量及等电点进行预测;在NCBI数据库下载其他物种组织蛋白酶L同源序列,利用Clustalx(1.83)和MEGA 6.0软件进行同源比对并构建进化树。运用RT-PCR和qRT-PCR对其时空表达特征进行分析。选取该基因的特异性片段,经PCR扩增,测序验证后将其连接至pET-28载体,转化至Rosseta感受态表达菌株,经IPTG在适宜温度条件下诱导,获得组织蛋白酶L重组蛋白。然后再利用镍离子亲和层析法对该蛋白进行纯化,获得纯度较高的重组蛋白。最后利用大肠杆菌对家蚕血液系统进行攻毒,检测家蚕组织蛋白酶L基因的表达水平。【结果】通过查询家蚕基因组数据库和生物信息学分析得出,家蚕组织蛋白酶L基因定位于家蚕第10号染色体上,基因编号为BGIBMGA006893,nscaf2860。基因开放阅读框全长687 bp,编码228个氨基酸,含有保守的Pept_C1结构域。通过在线网站预测,得出该蛋白酶的分子量为26.132 k D,等电点为4.57。进化分析表明该基因与同为鳞翅目昆虫的草地贪夜蛾和黑脉金斑蝶亲缘关系最为接近。RT-PCR显示该基因集中表达于血细胞,在血液不同龄期也较高表达。用His抗体检测经纯化后的蛋白,最终成功孵育出纯化后的蛋白条带;大肠杆菌个体攻毒免疫试验检测显示,其mRNA表达水平随攻毒时间呈现抛物线式的显著性变化规律,从而揭示出BmCat L与家蚕免疫系统的关联性。【结论】克隆获得家蚕组织蛋白酶L基因的cDNA序列,发现其特异性高表达于血细胞。通过原核表达和蛋白纯化成功获得了该基因的重组蛋白。大肠杆菌的刺激能够显著上调其表达,推测组织蛋白酶L可能参与家蚕免疫反应。     

真空、空气和气调包装对冷藏鱼糜制品品质的影响

为研究真空、空气和气调3种不同包装方式对冷藏鱼糜制品品质的影响,以鱼糜制品中的鱼丸为对象,通过测定鱼丸在(3±0.5) ℃冷藏期间微生物的种类和数量、理化指标和感官指标的变化情况,评价真空包装(vacuum packaging,VP)、空气包装(Air)、气调包装(M1,50%CO₂+50%N₂;M2,75%CO₂+25%N₂)对鱼丸品质的影响。结果表明,空气包装和真空包装鱼丸中的优势腐败菌是微球菌属、明亮发光杆菌和乳酸菌属,其次是假单胞菌和酵母菌。75%CO₂+25%N₂和50%CO₂+50%N₂的气调包装鱼丸中主要的优势腐败菌是明亮发光杆菌和乳酸菌属,其次是微球菌属。与空气包装和真空包装相比,75%CO₂+25%N₂和50%CO₂+50%N₂的气调包装完全抑制了酵母菌、假单胞菌的生长。75%CO₂+25%N₂和50%CO₂+50%N₂的气调包装比真空包装和空气包装更有利于抑制鱼丸中微生物的生长和TVB-N值的增加,保持pH、白度和感官品质的稳定,延长鱼丸的货架期。在(3±0.5) ℃冷藏条件下不同包装对鱼丸品质的保持效果好坏依次为M2,75%CO₂+25%N₂＞M1,50%CO₂+50%N₂＞VP＞Air,其对应的货架期分别为49、42、21和14 d。     

济源市农机免费管理成效显著

按照农业部和河南省农机局贯彻落实农机安全监理惠农政策的相关要求,从2012年4月1日起,河南省济源市政府在全市范围内全面推行农机免费管理,免征费用包括牌证工本费、安全技术检验费和驾驶许可考试费等农机监理行政事业性收费,成为河南省第一个全面实     

草原上的骏马

正~~     

遥望祁连

正~~     

建设生态型林业生产基地问题研究

随着信息和科技的不断发展,林业生产告别了原先的盲目性,注重以资源和环境为根本,积极建立各类新型林业生产墓地.在提升环境效益的同时也带来了可观的经济效益.我国的林业生产改革目前还处于发展阶段,在经营管理、技术研发等方面急需注入生机和活力,以便更好地发挥林业生产的潜力,造福社会.为此,运用可持续发展的理念,构建生态型林业生产基地非常必要.     

以统筹城乡发展为手段解决“三农”新难题

2004-2009年,中央已连续出台6个指导"三农"工作的一号文件.在"三农"政策方向标的指引下,我国"三农"情况持续向好:粮食连续6年实现增产,农民工就业快速回升,农民收入连续6年较快增长,农村体制创新取得新的突破,农民生产生活条件加快改变,农村民生状况明显改善.