长江中上游圆筒吻鮈群体线粒体Cyt b遗传多样性分析

为探明大坝建设及过度捕捞等可能会对圆筒吻鮈资源造成的影响,采用线粒体DNA Cyt b基因序列对长江中上游宜宾、泸州、合江、江津、巴南、涪陵和黄冈7个圆筒吻鮈(Rhinogobio cylindricus)群体进行研究,分析其遗传多样性及遗传结构。结果表明:在获得的998 bp序列长度中检测到14个变异位点,140尾样本定义15个单倍型,平均单倍型多样性(Hd)和平均核苷酸多样性(Pi)分别为0.625、0.000 77,说明圆筒吻鮈种群遗传多样性较贫乏。分子变异方差分析(AMOVA)表明圆筒吻鮈地理群体间未出现显著遗传分化。单倍型Network网络分析呈星型结构,邻接系统发育(NJ)树显示单倍型没有出现高支持率的分支,表明群体内部没有发生遗传分化。中性检验、错配分布及BSP分析均表明圆筒吻鮈发生历史种群扩张事件,种群扩张发生在0.06 Ma(百万年前)。综上表明,圆筒吻鮈的群体遗传多样性较低,群体间遗传分化不显著,建议将圆筒吻鮈群体作为一个整体就地保护,并在今后应加强长期监测。     

长江上游宜宾江段鱼类早期资源现状研究

本研究于2017―2019年每年4―7月在宜宾江段开展鱼类早期资源调查。结果显示,宜宾江段有鱼类22种,隶属于3目5科,以鲤科(Cyprinidae)鱼类为主,其中,产漂流性卵鱼类13种,特有鱼类6种。不同鱼类繁殖时间具有明显的年内和年间差异,但均在6月进入繁殖盛期。2017―2019年,鱼卵总径流量分别为12.10×106、70.42×106和35.77×106粒,鱼苗总径流量分别为30.95×106、41.47×106和39.44×106尾,其中,特有鱼类3年累计总卵径流量为15.91×106粒。经推算,在宜宾江段分布着多个产漂流性卵鱼类的产卵场,规模较大的产卵场主要分布在周坝、桃子湾和华龙码头3处。吻 (Rhinogobio typus)产卵场从东岳庙至向家坝坝下均有分布,3年累计产卵量最大达40.93×106粒,且吻 产卵场有向下游迁移的趋势。草鱼(Ctenopharyngodon idellus)产卵场主要分布在马铭溪码头和桃子湾。CCA分析结果显示,水位、水温和流量等环境因子对鱼卵密度有不同程度的影响,犁头鳅(Lepturichthys fimbriata)和花斑副沙鳅(Parabotia fasciata)在水温和流量较高时产卵;草鱼和小眼薄鳅(Leptobotia microphthalma)繁殖条件相近,与水位、流量和流速相关性较高;吻 和铜鱼(Coreius heterokon)产卵受溶解氧和透明度变化的影响较大。虽然受到金沙江下游梯级水电开发等多种因素的影响,但宜宾江段作为保护区的重要组成部分,仍是多种鱼类产卵繁殖的重要分布区,近年来,资源量呈上升趋势缓慢恢复。建议加强该江段早期资源研究,开展生境保护与修复,落实好“十年禁渔”,以促进资源恢复。     

番茄U6启动子的克隆及CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立

【目的】从番茄中克隆高效转录的SlU6启动子,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,并在番茄中建立CRISPR/Cas9系统,为番茄功能基因组学和分子育种研究提供技术基础。【方法】采用PCR方法从‘中蔬四号’番茄品种中克隆4种SlU6启动子,利用Transfer PCR方法分别对4个启动子进行两种不同长度的截短,分别构建8个截短的SlU6启动子驱动GUS的植物融合表达载体。利用农杆菌瞬时转化法分别转染番茄叶片,通过GUS染色筛选出在番茄叶片中转录活性较高的SlU6-2启动子。采用DNA重组技术构建以SlU6-2为启动子驱动sg RNA,以番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体。载体构建成功后,采用PEG法转化番茄原生质体,提取基因组DNA,采用酶切/PCR法分析内源基因突变情况;采用测序法分析内源基因突变的类型。利用突变位点频率分布图来验证番茄内源启动子在番茄CRISPR/Cas9系统中的有效性。【结果】经过两轮PCR,共获得4种8个不同长度的番茄U6启动子,其长度分别是452、202、448、206、433、190、448和218 bp,启动子序列比对分析发现番茄U6启动子与拟南芥U6启动子一样,也含有比较保守的两个元件,USE和TATA框。成功构建了8个SlU6启动子分别驱动GUS的植物融合表达载体。番茄叶片染色结果显示转化后的番茄叶片均被染成蓝色,表明克隆的番茄8个SlU6启动子均具有转录活性。选择SlU6-2P4为启动子驱动sg RNA,成功构建番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,验证结果表明番茄内源启动子SlU6-2P4能有效地驱动sg RNA的转录,并成功实现对番茄内源基因的编辑。内源基因突变的类型都为碱基替换,突变热点仅存在于内源基因靶序列区。【结论】成功克隆了4种在番茄叶片中高效转录的SlU6启动子;基于SlU6-2启动子的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,在番茄中成功实现对内源基因的编辑。     

棉花U3和U6启动子在CRISPR/Cas9基因组编辑体系中的功能鉴定

【目的】对已克隆的海岛棉U3和U6启动子进行功能鉴定,为构建棉花CRISPR/Cas9多位点基因编辑技术体系提供更多可用的U3和U6启动子。【方法】分别构建以GbU3-2P和GbU6-7P为启动子驱动sg RNA,以抗旱负调控基因GGB为靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体,然后在新海16的棉花叶片原生质体中进行功能鉴定。通过Polymerase chain reaction方法富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核心片段,并利用PEG瞬时转化法将核心片段转入原生质体中。提取转化后的原生质体基因组DNA,采用酶切/Polymerase chain reaction法分析棉花GGB基因的突变情况并测序验证。最后绘制靶基因突变的频率分布图来计算该CRISPR/Cas9系统的编辑效率和确认突变的真实性。【结果】靶基因测序结果显示靶标位点序列突变的类型全部为碱基替换。【结论】以GbU3-2P和GbU6-7P为启动子的CRISPR/Cas9基因编辑体系可以成功地定点编辑棉花GGB基因的序列,引起基因突变。     

棉花不同GbU6启动子截短克隆及功能鉴定

U6启动子是CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统中驱动sgRNA转录的重要元件,而使用较短序列的启动子也是构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体的基本要求之一。将已经克隆的海岛棉GbU6-5P启动子(长度为1166 bp),采用Transfer PCR方法成功地截出6个长度不同的U6启动子,其长度分别为672、468、358、280、202和105 bp,并分别构建了6个启动子驱动的GUS融合植物表达载体。将构建好的6个GbU6-5Ps::GUS-pCAMBIA1300与初始克隆的GbU6-5P::GUS-pCAMBIA1300植物表达载体一起利用农杆菌真空渗透转化法分别转染棉花花粉。GUS组织化学染色显示,克隆到的7个不同截短大小的GbU6-5P启动子均能驱动GUS基因在棉花花粉中转录,棉花花粉被染成蓝色但颜色深浅存在显著差异。结果显示启动子长度越短,其转录活性越高。而且另外两种棉花U6启动子GbU6-1P和GbU6-7P也表现出类似的结果。本研究克隆了3个短小的、在棉花花粉细胞中具有转录功能的GbU6启动子。结果显示更短的U6启动子具有更高的转录活性,而且这一特点在不同U6启动子上具有共性。这预示着使用更短U6启动子不仅符合构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体的要求,而且会提高sgRNA的转录水平,进而可能提高基因组编辑效率。     

番茄不同截短U3启动子的克隆及功能分析

从中蔬四号番茄品种中克隆能在番茄叶片中高效转录的SlU3启动子,为今后利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行分子育种奠定了基础。采用2轮PCR的方法,第1轮PCR从中蔬四号番茄品种中克隆了3种SlU3启动子,再采用Transfer PCR方法分别对3个启动子进行截短,共得到6个不同长度的启动子,并分别构建6个截短的SlU3启动子驱动GUS融合植物表达载体,利用农杆菌转化法分别转染番茄叶片。运用DNAMAN软件对已克隆的SlU3和拟南芥AtU3启动子序列具有转录功能的必要元件进行序列分析;经过2轮PCR,首先从中蔬四号番茄品种中克隆了3种SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4P启动子,其长度分别是1 156,1 114,1 147 bp,再采用Transfer PCR方法分别对3个启动子进行截短,共得到6个不同长度的启动子,其长度依次是489,318,450,248,457,248 bp,并分别构建6个截短SlU3启动子驱动GUS融合植物表达载体,启动子序列比对分析发现,番茄U3启动子与拟南芥U3启动子一样,也含有比较保守的2个元件,USE和TATA框,2个元件之间的位置比较固定。利用农杆菌转化法分别转染番茄叶片,结果显示,成功侵染后的番茄叶片均被染成蓝色,表明已克隆的6种不同截短番茄SlU3启动子均具有转录活性。成功克隆了6种在番茄叶片中高效转录的SlU3启动子,为构建番茄CRISPR/Cas9基因编辑载体提供更多高效的内源启动子。     

贵州省地方本科院校体育教育专业羽毛球课程体系构建的调查研究

采用文献资料法、问卷调查法、数量统计法和访谈法对贵州省地方本科院校体育教育专业羽毛球课程体系构建的相关问题进行了调查。结果表明,贵州省地方本科院校羽毛球课程设置目标主要集中在培养学生教学能力、专项技能和社会服务上;羽毛球课程内容设置上技能版块占的比例较大,缺少实践能力的课程设置;教学方法和手段较单一;体育教师对羽毛球课程建设的取向不尽相同。根据贵州经济社会发展的实际情况提出了相关的建议。     

长江上游珍稀特有鱼类国家级自然保护区干流段鱼类群落结构特征分析

长江上游珍稀特有鱼类国家级自然保护区位于向家坝坝下江段，随着金沙江下游梯级水电站相继蓄水运行和“十年禁渔”政策的实施，保护区干流段鱼类群落可能会发生改变。为探究“十年禁渔”前保护区干流段鱼类群落结构特征，基于该江段2017—2019年渔获物监测数据，对鱼类种类组成、生态类型、群落相似度、物种优势度、生物多样性以及群落结构稳定性等特征进行分析。结果显示，本次调查共采集到鱼类134种，隶属于7目21科83属，其中长江上游特有鱼类有27种，外来物种有12种，分别占总种类数20.15%和8.96%。鱼类群落以底层、产沉性卵、杂食性鱼类为主。等级聚类分析(Cluster)和非度量多维尺度分析(NMDS)显示，在一定的相似性水平上，保护区干流段鱼类的群落类型基本可分为3组，宜宾、泸州与合江可以聚为一组，巴南、江津分别独立成组。保护区干流优势种共有14种，其中瓦氏黄颡鱼是整个研究区域的优势种，在合江站点的优势度最高，IRI值为27.00%。Shannon-Wiener指数、Simpson指数、Margalef指数和Pielou指数变化范围分别为2.725～3.306、0.883～0.942、5.83...     

梯级水电站运行条件下长江上游鲢早期资源时空分布格局

为探究在金沙江梯级水电站运行的影响下,长江上游鲢(Hypophthalmichthys molitrix)早期资源分布及补充机制,选取2017—2019年5—7月长江上游早期资源调查数据,并运用基于Tweedie分布的广义相加模型(GAM)分析影响其时空分布格局的主要环境因子。结果表明, 2017—2019年鱼卵密度呈现一致的变化趋势。在空间上,距离大坝最远,流量、水温最高,透明度较低的江津江段鲢鱼卵密度最高,宜宾江段未调查到鲢鱼卵;时间上, 6月的鱼卵密度显著高于5月和7月,推测6月为长江上游鲢的繁殖盛期。广义相加模型结果显示,显著影响鲢鱼卵密度空间分布的主要环境因子为流量、离坝距离、透明度和水温(P<0.05)。在水温21～23℃,流量6000～14000m3/s,透明度小于50 cm的范围内,鲢鱼卵密度分布较为集中。综合上述结果表明,金沙江梯级水电站运行下泄的低温、低流量和高透明度水严重影响了大坝附近江段的鲢自然繁殖,而随着与大坝距离的增加和沿江支流的汇入,大坝对鱼类繁殖的影响程度逐渐削弱,从而形成纵向恢复梯度。产卵量与水文指标相关分析表明,产卵量与涨水持续时间和流量涨幅呈...