食用菌分子转化研究状况

遗传育种是提高食用菌产量和质量的有效途径之一。传统的遗传育种方法周期长、见效慢，现代分子转化技术则提供了一种更为高效快捷的育种方式。最早报道的食用菌转化是1991年Challen等利用PEG法把外源DNA导人双孢蘑菇的原生质体中，获得转化子；随后又相继报道了几例食用菌如双孢蘑菇、平菇、草菇、杨树菇和香菇的转化试验。但至今尚未建立起有效的食用菌转化系统。目前在食用菌的转化研究中存在的问题主要有：（1）假阳性菌落的干扰；（2）外源DNA整合率不高；（3）外源基因整合后表达率不高；（4）转化子不稳定。其中影响转化的主要因素是低整合率和低表达率。遗传育种是提高食用菌产量和质量的有效途径之一。传统的遗传育种方法周期长、见效慢，现代分子转化技术则提供了一种更为高效快捷的育种方式。最早报道的食用菌转化是1991年Challen等利用PEG法把外源DNA导人双孢蘑菇的原生质体中，获得转化子；随后又相继报道了几例食用菌如双孢蘑菇、平菇、草菇、杨树菇和香菇的转化试验。但至今尚未建立起有效的食用菌转化系统。目前在食用菌的转化研究中存在的问题主要有：（1）假阳性菌落的干扰；（2）外源DNA整合率不高；（3）外源基因整合后表达率不高；（4）转化子不稳定。其中影响转化的主要因素是低整合率和低表达率。遗传工作者围绕如何提高整合率和表达率，不断改进转化方法、转化材料、标记基因、启动子，以期提高转化率，建立一个完善的转化体系。现就筛选标记、启动子、转化方法、整合方式及将来研究方向等方面，用具体的研究实验分析食用菌转化工作现状、取得的成绩和存在的问题。     

腹泻性贝毒大田软海绵酸间接竞争ELISA检测方法的建立

大田软海绵酸(OA)是腹泻性贝类毒素(DSP)的主要成分,其藻源分布广,在我国引发的中毒事件最多,危害最大[1],已被列为最重要的食物中毒之一,而我国迄今为止尚没有一种较合适于现场使用的软海绵酸检测方法,因此研制我国自己的检测软海绵酸的方法已成为当务之急.与其他检测方法相比,酶联免疫法具有灵敏度高、特异性好、重复性高和检测准确快速的优点[2],在现场快速检测上具有开发前景,近年来在赤潮藻毒素快速检测方面得到重视和发展.本实验室在成功制备高效价OA单克隆抗体的基础上,初步建立了检测OA的间接竞争酶免疫学检测方法,为研制具有自主知识产权的相关检测试剂盒奠定了基础.     

GUS基因瞬时表达检测香菇顺式因子的调控功能

设计了一个顺式元件功能检测载体pYF3553,该载体以GUS为报告基因,其上游连接一段由待测香菇(Lentinula edodes)克隆片段与酵母Cyc1基本启动子组成的杂合启动子。将编号为XG108和XG111的香菇克隆序列构建的检测载体命名为pXG108p、XG111。将pXG108转化到香菇原生质体中,结果被测样的GUS瞬时活性比对照增加一倍,表明GUS基因得到了表达,其上游调控元件具有调控功能。对比pXG108和pXG111转化后的表达结果,其GUS瞬时表达活性表现出差异,这种差异与克隆片段在酵母中的表达差异相一致。分析了利用GUS瞬时表达验证未知香菇顺式元件的优缺点。     

利用SMART技术构建海带配子体cDNA文库

用Trizol试剂提取海带配子体总RNA,用SMART cDNA文库构建试剂盒构建cDNA文库。经测定原始文库滴度达到1.1×108Pfu/ml,文库有500μl体积,库容量为5.5×107Pfu,通过PCR检测,文库的重组率达100%,扩增出的片段主要集中在0.8~1.8 kb,平均插入片段长度约为1.34 kb。这些数据表明,已获得高质量的海带cDNA文库,为海带基因资源保存及新基因的克隆奠定了基础。     

食用菌分子转化研究状况

概述了食用菌转化取得的进展和存在的问题,详细介绍了筛选标记、启动子、转化方法、整合方式以及将来的研究方向等方面的研究状况.筛选标记主要有营养缺陷型、药物抗性标记;启动子主要是同源启动子ras基因和gpd基因启动子;转化方法主要有PEG法、电击法、限制性内切酶介导法、农杆菌介导法,对比分析了各种方法的优缺点;重组方式主要是多位点整合;甲基化是导致转录水平低的一个原因;可能的提高转化率措施有采用强启动子、加入同源片段进行同源整合.     

抗腹泻性贝毒软海绵酸多克隆抗体的制备与检测

制备了腹泻性贝毒软海绵酸(okadaic acid,0A)的多克隆抗体,鉴定了抗体特性.利用半抗原BSA偶联小分子毒素OA,制备完全抗原OA-BSA,免疫两只新西兰白兔,分离、纯化抗血清.用间接ELISA方法测定抗体效价,两个兔抗血清效价均达到128,000以上.IC50为2.852 ng/mL.DOT BLOT测定抗体特异性,结果表明,抗体与抗原有特异性反应.试验表明,抗OA多克隆抗体制备成功,其质量较好,可用于将来的免疫检测研究.     

2种活菌饲料对金鲫幼鱼肠道及水体微生态的影响

研究了2种活菌饲料对金鲫幼鱼肠道及水体菌群结构的影响,并分析了饲料、水体及肠道菌群进化关系。选取270尾规格整齐、体质健壮,平均体质量(8.49±0.26)g的金鲫幼鱼,利用嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌制备2种活菌饲料,以基础饲料为对照组A,基础饲料添加复合菌液为试验组B,复合菌液发酵基础饲料为试验组C,于室内循环水养殖系统中进行饲养试验。8周的饲养表明,与A组相比,摄食B组饲料的鱼,质量增加率显著提高5.15%(P0.05);摄食C组饲料的鱼,质量增加率显著降低3.44%(P0.05);养殖末期试验组水体中多核杆菌属、微小杆菌属等相对丰度明显增加(P0.05),黄杆菌属等相对丰度明显降低(P0.05),B组水体菌群物种丰度降低,多样性无明显变化,C组水体菌群物种丰度和多样性均明显降低;养殖末期B组试验鱼肠道菌群中气单胞菌属相对丰度明显降低(P0.05),微小杆菌属、柠檬酸杆菌属等相对丰度显著增加(P0.05),菌群多样性变高,物种丰度无明显变化;C组试验鱼肠道菌群中不动杆菌属、假单胞菌属等几乎消失,气单胞菌属、微小杆菌属、柠檬酸杆菌属等占绝对优势地位,菌群结构趋于简化。     

几条随机克隆的香菇顺式因子特性分析

分析了6个利用启动子探测载体和酵母表达体系克隆得到的香菇顺式调控因子的调控稳定性和序列结构特征。在酵母中进行2次转化,根据在X-gal培养基上的显色初步研究其调控稳定性;根据显色深浅不同,判断其调控能力的强弱,并结合序列特征结构进行分析。结果显示,克隆片段在酵母中具有稳定的调控功能,所克隆序列具有丝状真菌生物启动子典型结构,如CT丰富区T、ATA框、GC框、CAAT框。详细分析了其中1条克隆片段序列特征,并与已知的香菇GPD启动子序列进行对比分析。初步探讨了香菇顺式调控元件的结构特点。     

当前我国农业科技推广的几种模式

目前我国农业科技推广方式有政府和民间组织两种,政府扶持的科技推广是目前我国农业科技转化主渠道,在不同的条件下应采用不同的新技术推广模式。农业科技推广主要模式有:官产学合作模式、农业科技推广体系模式、科技示范工程及示范园地模式、公司 农户模式、农业合作社模式等。     

GUS基因瞬时表达检测香菇顺式因子的调控功能

设计了一个顺式元件功能检测载体pYF3553,该载体以GUS为报告基因,其上游连接一段由待测香菇(Lentinula edodes)克隆片段与酵母Cyc1基本启动子组成的杂合启动子。将编号为XG108和XG111的香菇克隆序列构建的检测载体命名为pXG108p、XG111。将pXG108转化到香菇原生质体中,结果被测样的GUS瞬时活性比对照增加一倍,表明GUS基因得到了表达,其上游调控元件具有调控功能。对比pXG108和pXG111转化后的表达结果,其GUS瞬时表达活性表现出差异,这种差异与克隆片段在酵母中的表达差异相一致。分析了利用GUS瞬时表达验证未知香菇顺式元件的优缺点。