MDV Meq-clustered miRNAs基因缺失BAC克隆株的构建及其体外增殖特性

为构建缺失马立克氏病病毒(Mareks disease virus,MDV)Meq基因簇microRNAs(Meq-clustered miRNAs的突变株,本研究在vv MDV GX0101细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)克隆的基础上,采用Red/ET同源重组技术将Meq-clustered miRNAs的编码基因进行缺失突变,经PCR鉴定及序列分析证明Meq-cluster miRNAs序列成功缺失后,提取Δmeq-miRNAs BAC DNA,转染鸡胚成纤维细胞(CEF)进行病毒拯救,用SYBR GreenⅠqRT-PCR检测病毒体外增殖特性。结果表明成功拯救出缺失MDV Meq-clustered miRNAs基因的感染性BAC克隆株GX0101Δmeq-miRNAs,且该缺失株与亲本株GX0101BAC具有相似的增殖曲线,Meq-clustered miRNAs是MDV体外复制的非必需基因。MDV Meq-clustered miRNAs基因缺失感染性BAC克隆株的成功构建为进一步研究MDV Meq-clustered miRNAs在MDV致病和致肿瘤方面的作用奠定了基础。     

甘草多糖对鼠伤寒沙门菌诱导的巨噬细胞氧化-抗氧化平衡紊乱的调解

为了探讨甘草多糖对鼠伤寒沙门菌诱发巨噬细胞氧化-抗氧化平衡紊乱的调节作用。将0、1、20和100 mg/L甘草多糖4个质量浓度组与小鼠腹腔巨噬细胞共孵育,同时每组按1∶1加入鼠伤寒沙门菌SL1344;利用ELISA试剂盒检测各组丙二醛(malondialdehyde,MDA),活性氧(reactive oxygen species,ROS),一氧化氮(nitricoxide,NO),诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS),谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSHPX),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)变化情况;利用荧光显微镜和荧光酶标仪观察甘草多糖对鼠伤寒沙门菌引起巨噬细胞产生ROS的影响;利用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)细胞毒性试剂盒检测巨噬细胞上清LDH水平。结果表明,鼠伤寒沙门菌可诱导小鼠腹腔巨噬细胞发生氧化损伤,导致NO(4.65±1.07)μmol/L、iNOS(15.46±0.92)U/mL、MDA(3.46±0.39)nmol/L和ROS(3.69±0.31)U/mL氧化水平以及LDH水平显著升高,而GSH-PX(15.58±1.35)nmol/L、SOD(13.32±0.92)NU/mL和T-AOC(8.36±0.60)U/mL抗氧化水平显著降低。荧光显微镜和荧光酶标仪检测显示,鼠伤寒沙门菌感染小鼠腹腔巨噬细胞ROS水平显著升高。甘草多糖呈剂量依赖明显降低细胞氧化水平和增强抗氧化水平。甘草多糖作为重要的免疫调节剂,能够调节鼠伤寒沙门菌引起的巨噬细胞氧化损伤,维持细胞氧化-抗氧化平衡。     

沙门菌Ⅵ型分泌系统组装、结构特征和分泌调控网络的研究进展

Ⅵ型分泌系统(type Ⅵ secretion system, T6SS)是革兰阴性菌中广泛存在的一种“分泌装置”和“杀伤机器”,其功能是将细菌毒素输送至原核或真核细胞中从而抑制/杀灭它们。T6SS在沙门菌致病过程中发挥着重要作用，能够独立编码5套T6SSs(T6SS-1～T6SS-5),分别由沙门菌毒力岛6(SPI-6)、毒力岛19(SPI-19)、毒力岛20(SPI-20)、毒力岛21(SPI-21)和毒力岛22(SPI-22)编码。T6SS参与沙门菌的种间竞争、生物被膜形成、金属离子摄取运输以及与宿主细胞相互作用，在沙门菌生活周期中发挥不可或缺的作用。本文主要综述沙门菌T6SS组装、基因组结构特征以及分泌调控网络最新研究进展，为深入研究沙门菌致病机制以及开发新的抗菌策略提供理论指导。     

动物药学专业多元化实践教学体系的探索

结合社会对动物药学人才培养的要求、学校人才培养定位及动物药学专业培养目标和专业特点,文章从实践教学环节、实践教学方法和实践教学环境等方面对动物药学专业多元化实践教学体系进行了设计与探索。     

6种中药成分对猪传染性胃肠炎病毒的体外抑制作用

【目的】为探讨连翘苷等6种中药成分抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的作用机制,明确其体外抗病毒作用效果,为抗TGEV的药物筛选提供依据。【方法】利用动物细胞培养技术,采用MTT比色法和细胞病变(CPE)观察法相结合,测定连翘苷、连翘苷元、绿原酸、咖啡酸、丁香酚、丹皮酚6种中药成分不同浓度下对猪睾丸细胞(ST)的毒性作用,通过观察细胞CPE情况,确定药物对细胞作用的最大安全浓度;同时测定病毒的TCID_(50),用细胞维持液配成100·TCID_(50)病毒悬液备用;将6种药物在最大安全浓度范围内连续2倍倍比稀释后,分别采用先感染病毒后加药、先加药后感染病毒、药与病毒混合后感染细胞3种不同作用方式进行体外增殖抑制试验,各试验组均设置正常细胞对照组和病毒对照组,每组设置3个重复,通过酶标仪测得630 nm处OD值,计算出不同作用方式下中药成分分别对TGEV的抑制率,筛选出抗TGEV活性较好的中药成分,并分别记录抗病毒效果最佳时药物的浓度;6种中药成分与病毒作用后,测定TGEV的病毒滴度并进行比较分析、RT-PCR鉴定各个药物单体对病毒RNA合成的抑制情况,进一步明确各中药成分对TGEV的抑制作用。【结果】连翘苷、连翘苷元、绿原酸、咖啡酸、丁香酚、丹皮酚的最大安全浓度分别为320、200、80、125、100、200μmol·L~(-1);抗病毒效果最佳时药物的浓度分别为:160、100、20、62.5、25、100μmol·L~(-1)。根据Karber法计算出初始TGEV的TCID_(50)为10~(-6.25)/0.1 m L;6种中药成分对TGEV在ST细胞上均有一定的增殖抑制作用,其中咖啡酸浓度为62.5μmol·L~(-1)时与100·TCID_(50)病毒混合作用后的病毒增殖抑制效果最好,相互作用72 h时,细胞形态依然能够保持圆滑、无固缩、完整,且细胞间轮廓清晰,仅有少量细胞脱落、死亡;此时测上清病毒的TCID_(50)为10~(-3.75)/0.1 m L,结果显示咖啡酸组病毒含量比病毒对照组10~(-6.45)/0.1 m L差异极显著(P0.01);通过酶标仪测得630 nm处OD值计算出抑制率能够达到84.4%,咖啡酸直接灭活病毒作用极其显著。其次是连翘苷、连翘苷元、绿原酸、丹皮酚及丁香酚,其病毒滴度分别为:10~(-4.75)、10~(-5.55)、10~(-5.55)、10~(-5.65)、10~(-5.75)/0.1 m L,但是这几种中药成分对病毒的抑制作用不够显著,抑制率大多在50%以下。另外,各中药成分对TGEV在ST细胞上的增殖抑制作用均为对TGEV的直接灭活作用最好,其次为对TGEV吸附阻断作用,最后为对TGEV的复制阻断作用。RT-PCR鉴定中药成分对病毒抑制作用,结果显示咖啡酸组条带与病毒对照组相比较暗,病毒效价较低,对病毒抑制作用效果显著;其次是连翘苷、连翘苷元、绿原酸、丹皮酚及丁香酚。【结论】6种中药成分在ST细胞上对TGEV均有一定的增殖抑制作用,其中咖啡酸直接灭活病毒作用最显著,有望被开发成抗病毒药物。     

丁酸梭菌C.L24蛋白酶产酶条件的优化

为了提高丁酸梭菌(Clostridium butyricum L24,C.L24)产蛋白酶的活性,试验对其产蛋白酶条件进行了探索。采用Folin酚法测定酶活,分别对碳源、氮源、pH、温度、接种量、培养时间等进行了筛选。结果表明丁酸梭菌C.L24产蛋白酶的最佳碳源是可溶性淀粉,最佳氮源是酵母膏,最佳培养液起始pH值是7.0,最佳培养温度是37℃,最佳接种量是2%,最佳培养时间是48h。在此条件下,C.L24产蛋白酶的酶活最高可达68.35U/mL,比优化前蛋白酶活提高了39.92%。     

鸡IL-2和新城疫病毒HN基因在毕赤酵母中的融合表达

为进一步研究IL-2对疫苗的免疫增强作用,本研究经PCR扩增分别获得鸡IL-2和新城疫病毒(NDV)HN基因片段,应用分子克隆技术获得含有融合基因IL2-HN的真核表达载体pPICZαA-IL2-HN,重组质粒pPICZαA-IL2-HN线性化后整合入毕赤酵母X-33染色体上,在甲醇诱导下表达融合蛋白,再进行SDS-PAGE、Western-blot检测。SDS-PAGE分析结果表明目的蛋白为分泌性表达,分子量约为100 ku,Western-blot结果表明目的蛋白具良好的免疫反应性。     

人α-防御素-3基因乳腺特异性表达载体的构建及在兔乳腺中的瞬时表达

为探索人α-防御素-3（HNP-3）基因在兔乳腺中特异性表达的可行性,将HNP-3基因与大鼠乳清酸蛋白（WAP）基因5′端调控区序列融合,定向克隆到PEGFP-1表达载体EGFP基因上游,在EGFP基因3′端加上His标签蛋白基因序列,构建了HNP-3基因乳腺定位表达载体pEGFP-WAP-HNP-S,将pEGFP-WAP-HNP-S与脂质体包裹后通过乳腺导管注射法转入妊娠母兔乳腺中,Westernblot和ELISA检测HNP-3融合基因在乳腺中表达和融合蛋白的表达水平,并用Ni亲和层析柱进行纯化。结果表明：分娩后初乳中即有分子质量为40kD的HNP-3融合蛋白表达,分娩后第4d达到高峰,表达量为265ng/mL。实验证明HNP-3融合基因在乳腺组织中能够特异性的表达。     

猪源支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

 【目的】探讨2003～2006年间支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica，Bb）在中国湖北等十余省市猪群中的流行病学分布和协同感染特性并对部分菌株进行生物学特性研究。【方法】采用病原菌的形态学观察、生化鉴定和PCR鉴定，从2 057份有肺炎或萎缩性鼻炎症状猪的肺脏等病料组织中分离出190株Bb和不同数量的其它共感染菌。经生化鉴定，药敏试验、血凝试验及动物试验等方法进行检测和分析。【结果】在中国湖北等十余省市的猪群中，不同省份Bb的总分离率介于7.3%～14.1%之间;不同年份Bb的总分离率介于7.3%～11.8%之间;2003～2006年间的Bb总分离率为9.2%;Bb的分离率与猪日龄有一定的关系。Bb最常见的共感染菌依次是链球菌（55.9%）、副猪嗜血杆菌（50.0%）、大肠杆菌（43.1%）、巴氏杆菌（25.5%）、绿脓杆菌（17.6%）和沙门氏菌（11.8%）。在43份有典型萎缩性鼻炎症状猪的病料中，分离出22株Bb、7株产毒素巴氏杆菌和6株绿脓杆菌;在分离出产毒素巴氏杆菌的7份病料中均同时分离出了Bb，而其中6份又同时分离出了绿脓杆菌。对2003年分离的31株Bb进行药敏试验、红细胞凝集试验和乳鼠皮肤坏死试验。结果表明：各菌株对15种药物的耐药谱不同，但对卡那霉素、庆大霉素、多粘菌素B、环丙沙星和舒普深高度敏感;各菌株均可凝集猪和羊的红细胞且能不同程度导致乳鼠皮肤坏死。【结论】在中国湖北等十余省市的猪群中，Bb与其它病原菌的共感染情况非常严重，且在萎缩性鼻炎的病猪中检出率最高。     

灾后慎防球虫病

1998年，我国经历了历史上罕见的洪涝灾害，为了帮助灾区人民重建家园，恢复畜禽生产，河南洛阳息中兽药有限公司特推荐该公司生产畜禽用系列精品，鸡病清、囊痘灵、百毒解、腹水净、咳喘停、增蛋宝、痛风散、球速杀、适应原等。本文特请程相朝、王拴伟两位专家结合该公司生产的高效抗球虫药──球虫杀，谈谈球虫病的防治。鸡球虫病是由艾美耳科的各种球虫害生于鸡的肠道引起的疾病，15－50日龄的仔鸡易感。病鸡表现贫血、消瘦和血痢，急性感染可造成大批死亡：中、轻度感染主要影响生长发育，并降低对其他疾病的抵抗力。本病分布很广，是条…