鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的原核表达及生物学活性分析

通过PCR方法扩增不含信号肽的鸡GM-CSF成熟蛋白基因,克隆至原核表达载体pET-32a（＋）,构建原核表达质粒p32GM-CSF,通过IPTG诱导重组鸡GM-CSF蛋白表达,经镍离子亲和层析纯化后,用MTT法检测表达重组蛋白的生物学活性,并制备兔抗鸡GM-CSF多克隆抗体。结果表明成功地构建了p32GM-CSF原核表达质粒,SDS-PAGE结果显示表达的重组蛋白约34 ku,主要以包涵体形式表达,纯化后得到高纯度目的蛋白。West-ern Blot结果表明,该重组蛋白能与制备的抗鸡GM-CSF抗体特异性结合。MTT试验证实,该重组蛋白具有明显增强鸡骨髓细胞增殖的生物学活性;这些研究结果表明,表达的重组chGM-CSF蛋白及其多克隆抗体拥有相应的生物学功能,这将为进一步研究鸡GM-CSF蛋白的生物学功能及其应用奠定基础。     

棘腹蛙TGF-α基因的克隆与组织表达分析

为了解棘腹蛙TGF-α基因信息和组织表达特性,采用RT-PCR克隆棘腹蛙TGF-α全长序列,发现棘腹蛙TGF-αc DNA全长1 021 bp,开放阅读框为486 bp,编码161个氨基酸,预测分子质量为17.28 k Da,其氨基酸序列与其他物种的相似性为65%~73%;利用实时荧光定量PCR方法对该基因的表达情况进行分析,发现在肝脏和胃脏有较高表达。本研究克隆了棘腹蛙TGF-α并对其组织分布进行了分析,为后期深入挖掘棘腹蛙TGF-α的生物学功能提供了参考。     

黑斑蛙胰岛素样生长因子-2原核表达载体构建

胰岛素样生长因子-2(IGF-2)是介导生长激素发挥生物学功能的重要因子,在动物机体的生长发育中具有重要作用。为对黑斑蛙IGF-2基因进行原核表达,本研究针对转录组数据中的黑斑蛙IGF-2序列,设计引物扩增IGF-2的完整基因,获得了全长为944 bp、ORF长为651 bp的序列;随后在黑斑蛙IGF-2的ORF两端添加限制性内切酶位点后亚克隆到p ET-32a(+)质粒中,构建了黑斑蛙IGF-2的原核表达载体。为获得黑斑蛙IGF-2的表达产物并探究其生物学作用奠定了基础。     

超鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的克隆与真核表达

    为了研究鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的生物学功能,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从刀豆蛋白(ConA)刺激的四川山地乌骨鸡外周血淋巴细胞中扩增出GM-CSF基因,进一步通过PCR等方法将该基因亚克隆入真核表达载体pCI-neo,构建出重组表达质粒pCI-GM-CSF,将pCI-GM-CSF转染COS-7细胞,提取表达产物进行活性检测.序列测定表明,四川山地乌骨鸡GM-CSF全基因长为435 bp,编码144个氨基酸,与GenBank 上公布的瓦赫宁鸡GM-CSF基因(AJ621740)氨基酸序列同源性达95.1%,与其他哺乳动物GM-CSF基因的氨基酸序列同源性低于30%.骨髓细胞增殖实验证实四川山地乌骨鸡GM-CSF能明显促进鸡骨髓细胞的增殖.以上结果表明,本实验成功克隆了四川山地乌骨鸡GM-CSF基因,证实四川山地乌骨鸡GM-CSF重组蛋白具有明显的生物学活性.     

不同干燥方式对蓝莓叶中酚类物质及其抗氧化活性的影响

【目的】探讨对蓝莓叶酚类物质含量及抗氧化活性的影响,为蓝莓叶的综合开发利用提供参考。【方法】以蓝莓叶为试验材料,设置不同干燥方式处理分别采用福林酚和比色法、亚硝酸盐比色法及高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）检测各样品的总酚、总黄酮、绿原酸和芦丁含量,采用亚铁还原力（ferric reducing antioxidant power,FRAP）、DPPH和ABTS⁺自由基清除法测定各样品的抗氧化能力,并分析样品酚类物质含量与抗氧化活性的关系。【结果】4种干燥方式对蓝莓叶中总酚、总黄酮含量及多酚类组份均有不同程度的影响。其中,真空冷冻干燥蓝莓叶中酚类物质含量最高,总酚（55.7 mg GAE·g^-1 DW）、总黄酮（104.8 mg RE·g^-1 DW）两者含量均为微波干燥方式的1.2倍左右,真空和热风干燥方式的3倍左右;多酚单体绿原酸（38.3 mg·g^-1）、芦丁（10.2 mg·g^-1）两者含量是微波干燥方式的1.5倍左右,热风和真空干燥方式的2-6倍。不同干燥方式对蓝莓叶的抗氧化活性影响显著（P＜0.05）。其中,真空冷冻干燥样品的抗氧化能力最强,DPPH自由基和ABTS⁺·的半清除浓度EC₅₀分别为54.8 µg·mL^-1和183.9µg·mL^-1,亚铁还原能力FRAP值达到6.0,抗氧化能力略高于微波干燥法（DPPH自由基和ABTS⁺·的半清除浓度EC₅₀分别为61.8 µg·mL^-1和225.7 µg·mL^-1,FRAP值4.0）。微波干燥法样品的抗氧化能力显著高于热风干燥（DPPH自由基和ABTS⁺·的半清除浓度EC₅₀分别为136.6 µg·mL^-1和575.1 µg·mL^-1,FRAP值1.7）和真空干燥方法（DPPH自由基和ABTS⁺·的半清除浓度EC₅₀分别为136.1 µg·mL^-1和225.7 µg·mL^-1,FRAP值1.8）(P＜0.05)。热风和真空干燥样品间抗氧化活性没有明显差异(P＞0.05)。相关性分析表明,除芦丁外,其他酚类物质含量与其抗氧化活性均存在极显著相关(P＜0.01)。【结论】真空冷冻干燥能较好地保留蓝莓叶中的多酚类物质,且具备较强的抗氧化能力和还原能力;微波干燥的效果略低于真空冷冻干燥,生产上可根据样品处理量的大小和具体情况选择干燥方式。     

猪传染性胃肠炎病毒SC-1株的分离与基因7的克隆分析

从四川某猪场采集疑似病例的腹泻粪样中分离到1株病毒,该病毒经过ST细胞传代培养盲传至第4代时出现病变。通过荧光抗体染色、病毒中和试验、TCID50试验、核酸类型鉴定,结合样品正染后在电镜下的观察结果,确定该毒株为猪传染性胃肠炎病毒,命名为TGEV SC-1株。参照GenBank中收录的TGEV基因7的序列设计了1对特异性引物,以SC-1株的细胞增殖毒的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得了大小约为303 bp的基因片段,包括完整的基因7序列片段（237 bp）,在GenBank上的登录号为DQ437507。核苷酸和推导的氨基酸序列比较分析结果表明,该毒株与其他毒株的同源性均在92.4%以上,TGEV SC-1株与美国的PURDUE和中国的TH-98毒株亲缘关系最近;与日本各分离毒株、中国TS株、美国Miller株、中国台湾TFI株和英国96-1933株的同源性较低。TGEV基因7在密码子使用的选择上,存在较大的偏向性;基因7编码蛋白在两端存在有明显的疏水性区域,在2～24和56～75位氨基酸残基处存在跨膜结构。     

多重PCR技术在动物疫病诊断中的应用

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术已经建立20余年,在这20多年里,它被广泛应用于生命科学各个领域,已经显示出了强大的工具性作用和旺盛的生命力。     

鸡IL-1β、IL-16基因真核表达质粒对IBV DNA疫苗的免疫增强效应研究

为研究鸡IL-1β、IL-16基因真核表达质粒对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)DNA疫苗免疫效果的影响,根据GenBank登录的鸡IL-1β和IL-16序列设计两对引物,采用RT-PCR方法从四川山地乌骨鸡外周血淋巴细胞RNA中克隆IL-1β和IL-16基因,与真核表达质粒pcDNA3.1(+)连接构建了pDNAIL-1β和pDNAIL-16。分别将两种重组质粒与IBVDNA联合免疫SPF雏鸡并进行攻毒试验。结果表明,pDNAIL-1β和pDNAIL-16均能促进血清中特异性抗体水平和外周血T淋巴细胞亚群数量的增加(p<0.05),增强IBV DNA疫苗对同型强毒的保护率15%～25%,pDNAIL-1β提升DNA疫苗的抗体水平的时间比pDNAIL-16多7d。试验表明,鸡IL-1β、IL-16基因真核表达质粒对IBV DNA疫苗的免疫具有增强作用。     

棘腹蛙Japonicin-pb抗菌肽的分离及表达谱分析

本试验旨在克隆棘腹蛙来源Japonicin-pb,了解该抗菌肽在不同生长温度及组织下的表达规律,为Japonicin-pb的开发提供线索。基于本实验室构建的棘腹蛙皮肤转录组数据库,利用反转录PCR从棘腹蛙皮肤组织中克隆Japonicin-pb前体序列,通过结构域比对的方法分析其结构。利用Real-time PCR检测3种Japonicin-pb在不同生长温度(15、18、21、24、27和30℃)及组织(血液、肌肉、肝脏和皮肤)的表达图谱。结果表明,本试验克隆到3种Japonicin-pb前体序列,结构域比对表明,三者拥有相同的N端信号肽和中间间隔区,长度分别为19、20和12个氨基酸残基的肽序列,命名为Japonicin-1apb、Japonicin-1bpb和Japonicin-3pb。Japonicin-1apb主要在皮肤组织中表达,且表达量随着生长温度的升高而逐渐增加;Japonicin-1bpb在不同组织或生长温度下的表达量差异均不明显;Japonicin-3pb主要在肝脏中表达,且生长温度对其影响不大。这些结果为棘腹蛙源3种Japonicin-pb后续功能研究以及开发应用提供了重要的序列及表达谱信息。     

中国大鲵“烂脚病”病原菌的分离鉴定

为了解重庆地区部分中国大鲵(Andrias davidianus)养殖场流行"烂脚病"的病因,对患"烂脚病"中国大鲵进行剖检后,在其肺部分离到一株优势菌CQWU2013,对该优势菌进行致病性实验、生理生化特性鉴定、16S r DNA测序和药敏实验。结果显示:中国大鲵"烂脚病"是由肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella mobilis)引起的,该菌为短链状排列的革兰氏阴性杆菌,其生理生化特性符合肺炎克雷伯氏菌的指标,16S r DNA序列同源性高达99.6%;药敏实验显示该菌对部分青霉素类、β-内酰胺类、氨基糖苷类和糖肽类药物耐药,对供试的20种药物中有7种药物出现明显的耐药现象。