纳米孔测序技术在疾病检测中的研究进展

近几年兴起的纳米孔测序技术(nanopore sequencing)为新一代测序技术,又称第三代测序技术,已开始应用于细菌、病毒、抗生素耐药及动物疫病等多个领域的检测。虽然在实际应用中仍存在一些瓶颈,包括测序精度不高、样品制备过程需要优化等,但该技术在疾病检测方面存在明显优势,包括可直接检测碱基修饰,超长读长、高分辨率和实时测序以及强大的生物信息学支持。未来,随着准确性的提高和性能的不断改进,加之在成本、测序时间和生物信息学分析方面的明显优势,纳米孔测序技术有望在临床实验室成为疾病检测的重要选择。本文通过综述该技术的原理、应用及在疾病检测中的优势,以期为纳米孔测序技术的进一步应用研究提供支持。     

塞尼卡谷病毒重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条检测方法的建立

为建立塞尼卡谷病毒(SVV)重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对SVV 3D基因设计了引物和探针,通过反应条件优化、特异性、灵敏性和重复性试验,建立了SVV RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法与口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒无交叉反应;在40℃、20 min内可检测的最低浓度为56拷贝/μL质粒标准品;通过3次重复试验检测,LFD检测线灰度值变异系数范围在4.49%~9.73%。利用该方法对120份国内临床样品进行检测,结果均为阴性。本研究首次建立了检测SVV的等温、快速RPA-LFD方法,读取结果不依赖任何仪器设备,为猪群感染SVV的现场快速诊断、流行病学研究和根除方案的制定提供帮助。     

案例分析——美国西尼罗河热疫情的暴发与防控

自1999年美国报道首例人西尼罗河病毒(WNV)感染以来,已出现了41 000多例临床感染病例和1 700多例死亡病例。1999年至2012年间,美国因人感染WNV住院造成的花费累计约7.78亿美元。同时,马属动物的治疗和免疫接种及WNV的监控也给美国带来了更严重的经济负担。针对WNV感染,美国采取了一系列防控措施,如建立国家虫媒病毒监测系统(ArboNET)、控制流行地区蚊虫、开发新型诊断方法、实施疫苗免疫等。但是,由于美国至少有65种蚊子能够传播WNV,感染WNV的候鸟可长距离传播病毒,加之季节、气候、人类活动等因素,导致WNV在美国难以根除。本案例提示我国应注重完善国家外来人兽共患病监测系统和实验室诊断方法 ;加强公共卫生实验室能力建设;利用大数据,建立WNV长期预警模型;确定理想的哨兵动物;加强政府与企业的合作以及疫苗、驱蚊剂的研发;加强宣传,突出防控重点。     

鹦鹉热衣原体荧光环介导等温扩增（LAMP）检测方法的建立

鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)是一种人兽共患病原体,能引起自然疫源性衣原体病,目前广泛分布于世界各地。本研究应用环介导等温扩增技术(LAMP),针对鹦鹉热衣原体23S RNA基因序列设计引物,并进行筛选以及敏感性和特异性试验,建立了鹦鹉热衣原体恒温荧光扩增方法。该方法在63℃恒温条件下1 h内即可显示结果,操作简单、快速,特异性强,灵敏度可达100拷贝/μL,且与流产衣原体、动物布鲁氏菌、牛结核分枝杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌无交叉反应;用国产仪器可直接通过检测荧光信号判读结果,既增强了准确性,也避免了开盖污染产生假阳性;应用建立的LAMP方法对实验室保存的临床DNA样品进行检测,发现检测结果与QPCR相同。该方法的建立弥补了传统检测技术的不足,为实现鹦鹉热衣原体的现场快速诊断提供了技术支持。     

非洲猪瘟或推动我国养猪行业的规范运行

多年来,我国畜牧管理部门和海关严防死守,意将非洲猪瘟等外来病挡在国门外。可是,2018年8月,该病毒突破防守,闯入我国,进而从东北蔓延到河南、江苏、浙江等地,对我国养猪业造成了极大的威胁。面对新来的疫病,沉着冷静、认清形势、做好防控才是目前的不二选择。     

戊型肝炎研究进展

戊型肝炎（hepatitis E,HE）是由戊型肝炎病毒（hepatitis E virus,HEV）引起的一种病毒性人兽共患传染病。自1997年在美国首次从家猪体内发现HEV以来,已确定该病毒能够感染人类以及猪、鹿、兔、骆驼、大鼠等多种动物。HEV通常会导致肝衰竭、慢性肝炎以及肝外神经和肾脏疾病。该病主要通过粪口途径传播,也可以通过血液传播。据估计,全球每年约有2 000万人感染HEV,年轻人病死率为0.5%~3.0%,而孕妇感染后死亡率可高达30%,因此HEV对公共卫生安全构成了巨大的威胁。本文主要对HEV的病原学、流行病学、诊断、防控等方面的研究情况进行综述,旨在进一步提高相关从业人员等对本病的认识,以便做好研究和防控应对工作。     

聚合酶螺旋反应（PSR）在病原微生物快速检测中的研究进展

聚合酶螺旋反应（polymerase spiral reaction,PSR）是基于环介导等温扩增技术（LAMP）和聚合酶链式反应（PCR）建立的一种新型恒温体外核酸扩增技术,其利用混合引物的设计思路和BstDNA聚合酶的链置换活性,实现了在体外等温条件下的核酸扩增,表现出灵敏性及特异性较PCR显著提高,引物设计较LAMP简单等优点,在保证检测灵敏、特异的同时,耗时相对较短,且操作简便,对仪器设备要求低,可肉眼直观判定结果,特别适用于公共卫生、动物健康、食品安全和生物防御等领域的快速诊断。本文介绍了PSR技术的原理及其在病原微生物检测方面的应用,以期为相关领域的检测技术研究提供参考。     

结核分枝杆菌复合群耐药性研究进展

<正>结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculo-sis complex,MTBC）的成员包括结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）、牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis,bTB）、非洲分枝杆菌（Mycobacterium africanum）、田鼠分枝杆菌（Mycobacterium microti）和山羊分枝杆菌（Mycobacterium caprae）等。其中结核分枝杆菌和牛分枝杆菌分别是人结核病、牛结核病的主要病原菌。至今,结核病仍是威胁人类社会及畜牧业发展的重要人兽共患传染病。     

表达非洲猪瘟病毒P72蛋白复制缺陷型重组腺病毒的构建及鉴定

本研究旨在构建能够表达非洲猪瘟病毒(ASFV)P72蛋白的缺陷型重组腺病毒。参考ASFV China-SY18株的基因序列,合成B646L基因。先将合成的B646L基因通过TOPO连接克隆到过渡载体pENTR/D-TOPO中;再将插入B646L基因的过渡载体pENTR/D-TOPO-ASFV-P72与pAd/CMV/V5-DEST腺病毒骨架载体进行重组,得到pAd-ASFV-P72重组质粒;重组质粒经PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞,连续传代后获得重组腺病毒。结果表明,获得的Ad5-ASFV-P72重组腺病毒的滴度为2.53×10~9 IFU·mL~(-1);经免疫荧光方法及Western blot鉴定ASFV-P72蛋白在Vero细胞中成功表达,且能够与ASFV标准阳性血清发生特异性反应。本研究成功获得能够表达ASFV P72蛋白的重组腺病毒Ad5-ASFV-P72,不仅为ASFV多基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了一定基础,还为ASFV相关血清学诊断方法的建立提供了安全有效的抗原。     

尼帕病的流行与防控技术研究现状

尼帕病首次暴发于东南亚地区的马来西亚,不但严重危害养猪业,而且严重影响着人类的健康。目前,孟加拉国、印度每年都有尼帕病暴发的报道。通过病毒N基因序列的系统进化分析发现,尼帕病毒进化分为两个发展方向。目前还没有研制出有效的抗尼帕病毒药物、疫苗。我国已经初步建立了实时定量RT-PCR和间接ELISA检测尼帕病毒的方法,虽然还没有发现该病的报道,但存在传入的风险。提议我国应将尼帕病纳入综合防控管理范围,积极开展尼帕病防控的宣传与培训,加强尼帕病的技术研究和监测,并制订相关的应急预案。