猪源IKKγ在原核和真核表达系统中的表达及其多克隆抗体制备

[目的]制备猪源IKKγ多克隆抗体,为进一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示IKKγ蛋白与猪瘟病毒(CSFV)间相互作用机制打下基础.[方法]利用RT-PCR从猪肾细胞(PK-15)中克隆原核表达的IKKγ基因功能片段(561 bp),与原核表达载体pET-32a(+)构建原核重组质粒pET-IKKγ,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经纯化和浓缩后,免疫小鼠制备猪源IKKγ多克隆抗体.同时克隆IKKγ基因全长序列(1356 bp),与真核表达载体pCMV-HA构建真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ,分别转染293T细胞和PK-15细胞,检测融合蛋白表达情况.[结果]以原核重组质粒pET-IKKγ转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导能表达出约40 kD的融合蛋白,且融合蛋白主要以可溶性蛋白形式进行表达,可通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化,已获得较高纯度的融合蛋白IKKγ.构建的真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ能在293T细胞中成功表达出IKKγ蛋白;制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能与293T细胞表达融合蛋白IKKγ发生特异性反应,其抗体效价为1:16000,与PK-15细胞表达IKKγ蛋白也具有良好的反应性,其中CSFV感染后36 h是IKKγ蛋白表达高峰期.此外,制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能在PK-15细胞中成功检测到IKKγ蛋白,说明猪源IKKγ多克隆抗体与真核细胞瞬时表达的IKKγ蛋白特异性良好.[结论]制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体具有效价高、特异性强等特点,可用于检测CSFV感染PK-15细胞中IKKγ蛋白表达水平,为下一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示NF-κB信号通路转录调节功能机制提供技术支持.     

四川冬春季参考作物蒸散量时空变化及其成因

为深入认识四川冬春季参考作物蒸散量(ET₀)的变化特征,利用1980—2016年四川35个气象站的逐日气象观测资料,采用泰森多边形、气候倾向率和克里金空间插值等方法对其冬春季ET₀的时空变化特征进行分析,并通过敏感性和贡献率分析了ET₀的变化成因。结果表明:ET₀的年代际变化呈先降后增的趋势,空间上呈明显的西南高东部低的分布特征,且高值区范围持续扩大,低值区范围波动缩小。ET₀的年际变化呈上升趋势,春季ET₀气候倾向率和空间差异明显大于冬季,且ET₀高值区与低值区空间分布受海拔高度影响明显。ET₀的同一日多年平均值自初冬至初春逐渐上升,1月22日—5月2日仅有8 d的ET₀值低于多年日平均值,具有明显连续的高值时段。ET₀对日照时数的变化最敏感,其次是对相对湿度与平均气温,对三者均呈高敏感性。平均气温的正贡献率是引起ET₀变化的主导因子,其次是相对湿度。研究时段内平均气温的升高对ET₀的正效应和相对湿度的降低对ET₀的负效应,超过了日照时数减少对ET₀的减少效应,导致四川地区冬春季ET₀呈上升趋势。     

微囊藻毒素对鱼类组织器官的毒理学研究进展

自从1878年澳大利亚学者George Francis首次报道有毒蓝藻的爆发以来,蓝藻水华现象已成为全球关注的环境问题之一[1].有毒蓝藻产生的微囊藻毒素(Microcystin,简称MCs),是淡水水体中存在最为普遍、毒性最强的毒素.已发现MCs可在无脊椎动物和脊椎动物中积累,引起很多器官的损伤[2].     

不同生长时期虎斑乌贼内壳营养成分含量分析比较

通过探究不同生长时期虎斑乌贼内壳的营养成分及矿物元素含量变化,为其开发利用提供理论依据。采用国家标准方法对不同生长时期(60、90、120、150日龄)虎斑乌贼内壳营养成分(水分、粗灰分、粗蛋白质、粗脂肪、多糖、氨基酸、脂肪酸)及矿物元素[5种常量元素——钠(Na)、钾(K)、镁(Mg)、铝(Al)、钙(Ca)和8种微量元素——铜(Cu)、铁(Fe)、锌(Zn)、硒(Se)、锰(Mn)、镉(Cd)、砷(As)、锶(Sr)]的含量进行测定。结果表明:不同生长时期时,粗灰分均是虎斑乌贼内壳的主要成分,含量为89.98%~92.06%,其含量随着生长不断增加,表现为150日龄时显著高于其他日龄时(P0.05);粗蛋白质的含量为2.82%~3.11%,其含量随着生长不断增加,表现为150日龄时显著高于60日龄时(P0.05);水分含量为3.93%~6.21%,其含量随着生长不断降低,表现为60日龄时显著高于其他日龄时(P0.05);相对于其他营养成分,虎斑乌贼内壳中粗脂肪、多糖含量较少,分别为0.41%~0.47%、0.34%~0.38%。不同生长时期的虎斑乌贼内壳中均检测出17种氨基酸,其中7种必需氨基酸(EAA)。不同生长时期的虎斑乌贼内壳中总氨基酸(TAA)、EAA和酸性氨基酸(AAA)含量分别为2.79%~2.93%、0.87%~0.98%和0.69%~0.87%,其中AAA含量随着生长不断增加,表现为150日龄时显著高于其他日龄时(P0.05)。各生长时期虎斑乌贼内壳中均以谷氨酸(Glu)含量(0.31%~0.43%)最高,组氨酸(His)含量(0.03%~0.07%)最低。不同生长时期的虎斑乌贼内壳中均检测出7种脂肪酸,包括3种饱和脂肪酸(SFA)、1种单不饱和脂肪酸(MUFA)和3种多不饱和脂肪酸(PUFA);在脂肪酸组分中以C22∶6n-3、C16∶0和C18∶0为主,其中C22∶6n-3含量(35.68%~37.62%)最高。生长时期对常量元素Na、Mg、Al和Ca及微量元素Cu、Zn和Sr含量有显著影响(P0.05),尤其是Ca、Mg、Zn含量,随着生长不断增加;重金属元素Cd、As含量很低,分别为0.001~0.003 mg/g和0.012~0.030 mg/g。综上所述,虎斑乌贼内壳营养丰富,Ca、M g、Zn含量高,且随着生长不断增加,具有良好的开发应用前景。     

微生态制剂在海参养殖中的应用

本文就微生态制剂在海参养殖中的应用及应用中应注意的问题作一综述。     

应用彗星试验研究产毒微囊藻喂食暴露对铜锈环棱螺肝细胞DNA的损伤

把铜锈环棱螺（Bellamya aeruginosa）暴露于3组不同成分的微藻悬浮液中[蓝藻组：只投喂产毒铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）;混合藻组：50%四尾柵藻（Scenedesmus quadricanda）＋50%产毒铜绿微囊藻;对照组：只投喂四尾柵藻],用酶联免疫检测法（Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）检测藻液和螺肝组织中的藻毒素浓度。结果表明,藻液中包括藻相和水相的总微囊藻毒素（MCs）浓度分别为：蓝藻组（36.34±4.12）μg·L-1;混合藻组（18.69±2.12）μg·L-1;对照组未检出。在喂食暴露的前6h内,混合藻组和蓝藻组螺肝组织中微囊藻毒素含量持续增长,而后出现下降趋势;第12h更换藻液并将微藻浓度调整至初始值后,肝组织中MCs含量又迅速回升。同期螺肝细胞DNA损伤指标彗星尾长（TL）、彗星尾距（TM）和彗星尾部DNA百分含量（Tail DNA%）也随螺肝组织中MCs含量发生相应变化,各项DNA损伤指标均在产毒微囊藻喂食暴露6h时达到最大值,之后,各项指标值有所回落,但第12h更换藻液后,DNA损伤再次加剧。整个实验期间（24h）,混合藻组和蓝藻组的DNA损伤指标均显著高于对照组,混合藻组均显著高于蓝藻组。说明铜锈环棱螺经产毒微囊藻喂食暴露后,其肝组织细胞的DNA受到损伤,且螺肝组织MCs积累越多,DNA损伤越严重。     

LHR在不同繁殖期牦牛睾丸组织的表达比较

【目的】探讨不同繁殖季节牦牛睾丸促黄体生成素受体(LHR)在牦牛睾丸的定位与表达变化,为牦牛繁殖季节性调控研究提供依据.【方法】用特殊染色结合生物显微技术观察不同繁殖期成年牦牛睾丸组织学特征变化,应用免疫组化法检测LHR在牦牛睾丸组织的分布和定位.【结果】光镜观察表明,不同繁殖期成年牦牛睾丸组织结构差异不明显,生精上皮及间质PAS阳性表达明显,AB主要在生精小管基膜阳性表达,PAS及AB均为繁殖期表达强于繁殖间期.免疫组化结果显示,LHR在繁殖期牦牛睾丸leydig细胞及生精上皮均为弱阳性分布,而在繁殖间期仅强表达于leydig细胞.【结论】高原地区牦牛睾丸组织繁殖间期以酸性粘多糖为主,繁殖活动增强主要与中性粘蛋白关系密切,LHR参与了不同繁殖期牦牛睾丸功能变化的调控.     

小鼠TLR3基因双敲除打靶载体构建及巨噬细胞RAW264.7TLR3-/-细胞系的建立

[目的]建立Toll样受体3(TLR3)基因缺失的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系,为探索狂犬病毒感染机体过程中TLR3在固有免疫反应中的作用机制提供理论依据.[方法]采用Golden Gate Kit试剂盒组装转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)打靶载体pTALEN-TLR3,经酶切和测序验证其连接正确后,通过脂质体瞬时转染RAW264.7细胞,转染后提取细胞DNA,用T7核酸内切酶酶切验证TALEN质粒剪切活性.[结果]TALENs左右臂分两部分连接,首先完成A、B部分的各自连接,然后分别将T1LA与T1LB、T1RA与T1RB、T2LA与T2LB、T2RA与T2RB连接,TALEN模块经过两次连接后的PCR鉴定结果显示,T1L、T1R和T2L的4个克隆均呈阳性,T2R有3个克隆呈阳性.T2L和T2R质粒共转染RAW264.7细胞后提取DNA为模板,经PCR扩增后用T7核酸内切酶进行酶切,酶切后的DNA电泳结果显示TALEN2剪切活性较强,共获得3条条带(931、555和376 bp).TALEN打靶载体pTALEN-TLR3转染RAW264.7细胞24 h后用胰酶进行消化,并加入800μg/mL G418进行筛选,7 d后获得细胞单克隆;挑选阳性细胞克隆进行T7核酸内切酶酶切鉴定及测序,结果发现4-1和4-40号细胞克隆为双敲细胞系,均缺失7 bp的核苷酸碱基,为非3整数倍碱基缺失,可造成后续基因移码突变,使细胞基因功能失活.[结论]通过TALEN技术可成功构建TLR3基因双敲除的小鼠巨噬细胞RAW264.7TLR3-/-细胞系,且可用于狂犬病毒感染细胞后细胞因子和TLR3间的关系研究.     

四种复合生物制剂对鲫鱼生长和免疫功能的影响

本研究旨在通过45 d的饲养试验,评价4种复合生物制剂对鲫鱼的生长性能及血清免疫、抗氧化和理化指标的影响,继而通过15 d的CCl4攻毒试验,观察4种复合生物制剂对鲫鱼肝脏的保护作用。研究结果表明:日粮中添加5%复合生物制剂Ⅳ组效果最佳,鲫鱼45 d增重率和血清碱性磷酸酶(AKP)及超氧化物歧化酶(SOD)活性(P<0.05)分别比对照组提高了9.5%、16.3%和24.1%;饵料系数比对照组降低了6.9%(P<0.05);血清谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)活性也较对照组降低(P≥0.05);粪便中异养菌的含量比对照组提高了2.7倍,其粪便中芽孢的含量比对照组提高了11.4倍;CCl4攻毒14 d后,四种复合生物制剂对肝脏有明显保护作用。综上,在饲料中添加益生菌、酶制剂和植物提取物复合而成的生物制剂可改善鲫鱼的生长性能和机体抗病能力,是抗生素替代品的选择之一。