二倍体和三倍体虹鳟精液低温保存寿命的研究

与二倍体(2n组)精原液做比较,以不同密度为组别,研究了4℃下两组(3n-HD和3n-LD)三倍体虹鳟(Oncorhynchus mykiss)精原液的保存时限。结果发现,随着保存时间的延长,精液中精子的活力和寿命逐渐降低。2n组、3n-HD组和3n-LD组虹鳟精原液中精子分别在保存5d、4.5d和12.5d后失去活力;在7d、15d和14.5 d后死亡,即三倍体虹鳟精原液4℃保存时间约为二倍体的2倍,说明低温短期保存三倍体虹鳟精原液可以取得较好效果。     

虹鳟杂交胚胎(2n♀×3n♂)的发育状况及其DNA倍性分析

雄性三倍体虹鳟(Oncorhyncus mykiss)可以发育至生理成熟并表现出较强的雄性副性征,性腺发育基本正常；雌性三倍体虹鳟性腺几乎不发育,并且存在着类雄性化的发育趋势.本研究拟通过对虹鳟杂交胚胎(2n♀×3n♂)发育状况及其DNA倍性的分析,进而确认三倍体虹鳟是否具有与二倍体虹鳟类似的生育能力并分析其原因.选取经两个世代家系选育的虹鳟优良品系二倍体雌性虹鳟作为母本,以热休克方法人工诱导的优质雄性三倍体虹鳟为父本,常规人工采集精卵授精,获得三倍体雄性与二倍体雌性杂交胚胎,观察杂交胚胎的发育进程,通过流式细胞仪检测杂交胚胎的DNA含量,进而与二倍体雌雄交配获得的胚胎对照确定杂交胚胎的倍性.结果表明,杂交胚胎的受精率、发眼率和孵化率均显著地低于对照组,杂交胚胎多数在发眼期之前死亡,破膜的胚胎在仔鱼期上浮前全部死亡.杂交胚胎的DNA含量分布范围较大,大致可以分为两个水平,接近84％的胚胎的DNA含量介于二倍体与三倍体之间,约为对照组DNA含量的2.5倍；约有16％的胚胎的DNA含量在三倍体和四倍体之间.本研究认为,染色体非整倍体化可能会引起杂交胚胎细胞核质不相容,进而导致基因表达调控紊乱,从而使杂交胚胎不能正常发育,无法完成由母体卵黄供给的内源营养向外源营养的转换,成为导致杂交胚胎发育过程中大量死亡,以及杂交仔鱼在破膜之后开始进食之前全部死亡的一个重要原因.     

荧光染色法检测虹鳟精子质量

本实验运用三种荧光染色方法对虹鳟精子的质量进行检测,并探讨荧光染色对虹鳟精子质量评价的可性及意义。在生殖季节采集虹鳟精液,分别进行Hoechst33342/碘化丙啶双染,吖啶橙染色及罗丹明123/碘化丙啶双染,然后将其制成涂片荧光显微镜下观察。经荧光染色的虹鳟精子质膜完整,DNA完整,可明显分辨出活体和死亡精子,线粒体膜功能正常精子的比率分别为90.7%、98.7%和96.4%。综上所述,结合三种检测方法可以简便快速地测定虹鳟精子的质量。     

虹鳟胚胎组织单细胞悬液制备方法的研究

采用0.01MPBS等渗液配制的浓度为70%的乙醇固定液对虹鳟活体胚胎进行固定,并以蒸馏水配制的浓度为70%乙醇固定液作为对照,探讨用于流式细胞术分析的胚胎组织单细胞悬液制备方法。实验结果表明:PBS-乙醇和蒸馏水-乙醇固定液均可获得分散良好的单细胞悬液,但蒸馏水-乙醇固定液制备的胚胎细胞悬液中细胞数量相对较少,细胞碎片明显增多,流式细胞仪检测G0/G1峰较宽。而PBS-乙醇固定液制备的细胞悬液,细胞形态完整、背景较干净,细胞粘连少,几乎没有细胞碎片,流式上机检测各参数值较理想;以PBS-乙醇固定液制备2n虹鳟胚胎单细胞悬液作为材料检测,其结果与以红细胞为对照的样品检测DNA相对含量结果相一致,均为50AU。本研究表明利用PBS-乙醇固定液制备鱼类胚胎组织单细胞悬液方法是可行的。     

二倍体和三倍体虹鳟精液低温保存寿命的研究

与二倍体（2n组）精原液做比较,以不同密度为组别,研究了4℃下两组（3n-HD和3n-LD）三倍体虹鳟（Oncorhynchus mykiss）精原液的保存时限。结果发现,随着保存时间的延长,精液中精子的活力和寿命逐渐降低。2n组、3n-HD组和3n-LD组虹鳟精原液中精子分别在保存5d、4.5d和12.5d后失去活力;在7d、15d和14.5 d后死亡,即三倍体虹鳟精原液4℃保存时间约为二倍体的2倍,说明低温短期保存三倍体虹鳟精原液可以取得较好效果。