合浦珠母贝C-型凝集素基因的序列特征和功能分析

通过EST筛选结合重测序法获得合浦珠母贝一种C-型凝集素cDNA的全长序列(命名为PoLEC1)。PoLEC1全长988 bp,5′-UTR为33 bp,3′-UTR为101 bp,开放阅读框为864 bp,编码287个氨基酸,分子量为31.68 ku,理论等电点约5.83。预测的氨基酸序列中含有信号肽(Met¹-Ser¹⁹)和糖结合位点。同源性分析结果表明,PoLEC1与其它物种C-型凝集素的的糖识别结构域序列的同源性在18.8%~28.6%,相似性在28.9%~50.0%之间。进化树分析结果表明,PoLEC1与栉孔扇贝聚为一支。组织表达分析表明,PoLEC1 mRNA在消化腺、外套膜、性腺、闭壳肌、肠、鳃和血淋巴组织均有表达,在消化腺中的表达分析表明,经溶藻弧菌刺激后2 h表达显著下调,而在4和24 h后表达显著上调。利用PoLEC1成熟肽构建原核表达载体,在大肠杆菌中进行重组表达。制备包涵体后,用IDA HisBind 树脂纯化得到单一的重组蛋白,凝菌试验表明该蛋白对大肠杆菌有明显的凝集作用。     

合浦珠母贝C型凝集素2的序列特征和表达分析

构建了合浦珠母贝(Pinctada fucata)的cDNA文库,并通过EST序列筛选和重新测序获得了一个新的C型凝集素基因的cDNA序列,命名为PoLEC2,其长度为1 659 bp,5’端非编码区为39 bp,3’端非编码区为45 bp,开放阅读框为1 575 bp,可编码524个氨基酸;PoLEC2蛋白的分子量约58.0 kD,等电点为5.2;PoLEC2蛋白包含一个信号肽序列(M1-A16)、一个MAM-2结构域和一个C型凝集素的糖识别结构域。同源性分析结果表明,PoLEC2与其他物种C型凝集素的糖识别结构域序列的同源性在26.5%～33.6%,相似性在45.1%～55.6%。组织表达分析表明,PoLEC2基因在肝胰脏、鳃、外套膜、性腺及肠组织中均有表达,经溶藻弧菌刺激后8h在肠组织中的表达量显著上调。     

合浦珠母贝组织蛋白酶L2基因的特征与组织表达分析

为了研究合浦珠母贝(Pincatada fucata)的先天免疫调控机制,利用cDNA文库筛选和重测序技术克隆了1个合浦珠母贝组织蛋白酶L的全长cDNA序列(命名为poCL2).poCL2 cDNA全长1 094bp,5'-非编码区(untranslated region,UTR)长21 bp,3'-UTR长80 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)为993 bp,编码330个氨基酸组成的多肽链,分子量为37.1 kD,理论等电点为6.9.poCL2蛋白由信号肽(Met1-Ala16)、前体域(Arg17-Asp113)和成熟域(Leu114-Val330)三部分组成,存在-个潜在的糖基化位点(Asn97),6个底物结合位点(Leu182,Met183,Ala249,Leu275,Gly278和Ser324),1个由半胱氨酸(Cys138)、组氨酸(His277)和天冬酰胺(Asn297)残基构成的催化位点和2个组织蛋白酶L签名序列(E42X3RX3WX2NX3IX3N61和G74X1NX1YX1D80).同源性分析表明,poCL2氨基酸序列与其他物种高度保守,相似性在61.5%～73.9%之间,同源性在44.4%～59.8%之间.进化分析显示,poCL2与其他无脊椎动物的组织蛋白酶L聚为一支,和淡水螺(Radix peregra)亲缘关系最近.组织表达分析表明poCL2 mRNA在消化腺、外套膜、性腺、闭壳肌、肠、血淋巴和鳃组织中均表达,外套膜表达量最高.应激实验表明,经溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)或脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激后,poCL2 mRNA在消化腺中的表达量显著上调,说明poCL2参与了合浦珠母贝的先天免疫应答反应,暗示其在合浦珠母贝先天免疫调控中发挥重要作用.