肝片吸虫CatB4蛋白分子特征及其免疫原性分析

【目的】明确肝片吸虫组织蛋白酶B4(CatB4)的分子特征及其免疫原性,为研究肝片吸虫CatB4蛋白的生物学特性及揭示其致病机理提供科学依据。【方法】通过RT-PCR扩增肝片吸虫CatB4基因,利用在线分子生物信息学软件对CatB4基因及其编码蛋白进行分子特征分析;构建原核表达载体pET-CatB4,经IPTG诱导获得融合蛋白后进行SDS-PAGE和Western blotting检测分析;并以融合蛋白CatB4免疫小鼠制备多克隆抗体,利用免疫组化对融合蛋白在肝片吸虫体内的表达进行定位分析。【结果】肝片吸虫CatB4基因片段为699 bp,其编码蛋白等电点(pI)7.95,理论分子质量25.89 kD,无信号肽和跨膜区,属于非分泌性蛋白;CatB4蛋白存在10个潜在的磷酸化位点、2个N-糖基化位点和7个N-肉豆蔻酰化位点,有9个抗原决定簇,具有高度保守的CatB结构域,是由无规则卷曲连接9个α-螺旋和8个β-折叠构成其空间结构。基于CatB4基因核苷酸序列同源性构建的系统发育进化树显示,肝片吸虫和大片吸虫聚为一支,二者的同源性为83.98%。SDS-PAGE检测和Western blotting分析结果均显示在41.80 kD处能检测到目的条带。以纯化融合蛋白CatB4与弗氏佐剂乳化后免疫的小鼠均可产生特异性抗体,证实融合蛋白CatB4具有较强的免疫原性;免疫组化定位分析结果显示,在肝片吸虫的卵黄腺腺体细胞、排泄管上皮细胞、肠道上皮细胞和卵黄腺管上皮细胞均发生特异性的抗原抗体反应,呈深棕色。【结论】诱导表达获得的融合蛋白CatB4可特异性识别绵羊肝片吸虫阳性血清,具有较强的免疫原性,且主要在肝片吸虫分泌排泄组织器官中表达,说明CatB4蛋白具有作为肝片吸虫候选抗原的潜力。     

单核细胞增生李斯特菌 sRNA 伴侣分子 hfq的基因克隆、表达及纯化

为克隆、表达单核细胞增生李斯特菌sRNA分子伴侣蛋白hfq基因，并纯化重组蛋白，通过PCR的方法从单核细胞增生李斯特菌基因组DNA中扩增出hfq基因，将扩增产物克隆于pMD18-T载体中，测序验证后，再将hfq基因亚克隆至表达载体pET-32a（＋）中，成功构建pET-32a（＋）-hfq原核表达载体。然后，转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，通过IPTG进行诱导表达，对表达蛋白进行可溶性分析，并采用Ni-NTA纯化目的蛋白。结果显示：克隆的hfq基因全长234 bp，编码77个氨基酸，通过SDS-PAGE可以检测到27 kDa的蛋白特异性条带；并从上清中纯化得到了Hfq融合蛋白。为进一步研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。     

单核细胞增生李斯特菌新型内化素lmo0549的分子特征及其表达

应用PCR技术对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)新型内化素lmo0549基因进行克隆和测序,并对其进行生物信息学分析;通过扩增获得Lmo0549蛋白氨基端抗原集中区序列,并将其亚克隆至pET-32a(+)表达载体,转入大肠杆菌中用异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,简称IPTG)诱导表达,应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,简称SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(western blot)鉴定重组蛋白的表达形式及其抗原特异性。序列分析结果表明,扩增得到的lmo0549基因全长为2 034 bp,编码677个氨基酸,其信号肽序列是前23个氨基酸,在Lmo0549蛋白氨基酸序列中,从N端到C端分别包括5个富含亮氨酸的重复基序(LRR)、1段PKD重复序列和1个WxL结构域;同时还存在N-联糖基化位点10个、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点14个、蛋白激酶C磷酸化位点15个。同源性分析显示,LM-SB5 lmo0549基因编码的蛋白氨基酸序列与标准株李斯特菌EGD-e,(NC_003210.1)蛋白氨基酸序列的同源性为88.04%,且在单核细胞增生李斯特菌中具有较高的保守性。SDS-PAGE分析显示,表达的Lmo0549蛋白氨基端抗原集中区具有与理论值33.8 ku相符的分子质量;蛋白质印迹法分析表明,重组蛋白Lmo0549与LM阳性血清可发生特异性免疫反应,为进一步探讨Lmo0549在LM侵入宿主细胞的分子作用机制奠定了前期基础。     

细粒棘球蚴GST-mu2基因的克隆、表达及重组蛋白反应原性研究

为了研究细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)谷胱甘肽S-转移酶mu 2(GST-mu 2)蛋白的反应原性,根据GenBank中Eg GST-mu2基因cDNA序列设计特异性引物,以Eg头节总RNA为模板,进行RT-PCR扩增,将PCR产物克隆到pMD19-T载体,测序验证后,将GST-mu2基因亚克隆至表达载体pET-28a中,构建pET-GST-mu2原核表达载体,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG进行诱导表达,并对表达蛋白进行反应原性分析。结果表明,GST-mu2cDNA全长660个核苷酸,编码219个氨基酸,该多肽含有2个N端酰基化位点,2个PKC磷酸化位点,3个CKⅡ磷酸化位点,1个TYR磷酸化位点,抗原表位区集中在28~70、147~219位;SDS-PAGE可以检测到32kDa的蛋白特异性条带;Western blot分析显示,表达的pET-GST-mu2重组蛋白能与Eg阳性血清发生特异性反应,具有较强的反应原性,为进一步利用GST-mu2蛋白作为Eg感染诊断的候选抗原奠定了基础。     

奶牛源金黄色葡萄球菌临床分离株的耐药特性、生物膜及其相关基因分布研究

【目的】为了解引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌(SA)分离株的耐药性及其生物膜特性。【方法】本研究采用纸片扩散法对新疆地区奶牛源临床分离的164株SA的耐药特性进行检测,并对MRSA进行判定;用BHI培养24 h形成生物膜,结晶紫染色后测其吸光度(OD570 nm)值,比较分析MRSA和MSSA菌株间生物膜形成能力;对生物膜形成相关基因的分布进行检测。【结果】164株SA临床分离株中共检出22株MRSA,检出率为13.41%;SA对青霉素、头孢西丁、红霉素、甲氧苄啶、四环素耐药株较多;MRSA对头孢类、氟喹诺酮类和大环内酯类抗菌药物的耐药率明显高于甲氧西林敏感SA(MSSA);24 h时,MRSA和MSSA生物膜生成能力差异显著(P0.05),MRSA菌株的生物膜生成能力显著高于MSSA菌株;MRSA菌株黏附素clf A、clf B、fnb B、Fib、cna、Fn BP基因携带率在54.55%~100%之间,显著高于MSSA菌株检出率(P0.05)。【结论】呋喃妥因、替考拉宁、磷霉素可作为优选药用于治疗MRSA和β-内酰胺类耐药株引起的严重感染。MRSA菌株较于MSSA菌株具有较强的生物膜形成能力,这与MRSA的较强抗性具有相关性。     

少孢节丛孢菌几丁质酶AO-801基因的分子特征分析及其多克隆抗体制备

为了研究捕食线虫性真菌——少孢节丛孢菌几丁质酶的生物学功能,对少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶AO-801基因进行克隆和分子特征分析,通过大肠杆菌表达AO-801重组几丁质酶,利用镍柱纯化技术纯化目的蛋白,免疫小鼠后制备AO-801几丁质酶多克隆抗体。结果显示,几丁质酶AO-801基因序列与少孢节丛孢菌标准株[Arthrobotrys oligospora Fres.,美国模式培养物集存库(American type culture collection,简称ATCC)24927]的核苷酸序列同源性为95.96%,氨基酸序列的同源性为97.34%。几丁质酶AO-801属于糖苷水解酶18家族,具有典型的几丁质酶催化区保守序列SIGGW和LDGVDVDWE,无信号肽序列,其二级结构以无规则卷曲、α螺旋和β折叠为主要结构元件,三级结构中有(α/β)8的圆桶形结构。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,简称SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western Blot)分析表明,重组几丁质酶蛋白的分子量约为59ku,与预期大小一致,与少孢节丛孢菌阳性血清能发生特异性反应。间接酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,简称ELISA)法的检测结果显示,获得的抗AO-801多克隆抗体血清效价达到1∶25 600。     

绵羊肺炎支原体核糖体蛋白30S RPS11基因的克隆、表达及重组蛋白免疫原性研究

本研究以绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)新疆流行株基因组DNA为模板,通过PCR扩增30S RPS11基因,对其进行分子特征性分析,并将其抗原表位集中区进行原核表达,分析重组蛋白免疫原性。结果表明,30S RPS11基因全长405bp,编码134个氨基酸,该蛋白是一种受磷酸化调控的蛋白,含有一个核糖体蛋白S11信号。SDSPAGE结果显示,筛选的抗原表位集中区重组蛋白分子质量为29kDa;Western blot分析显示,该重组蛋白可被MO阳性血清特异性识别,说明其具有良好的反应原性;小鼠免疫试验表明,重组蛋白诱导机体产生的间接血凝抗体效价可达1∶32~1∶64,表明其具有较强的免疫原性。本试验首次证实MO核糖体蛋白(30SRPS11)具有良好的免疫原性和反应原性,为MO血清学诊断及亚单位疫苗研发提供了科学依据。     

细粒棘球蚴RTN4基因的克隆及序列分析

【目的】克隆细粒棘球蚴(Eg)内质网膜蛋白4(Reticulon-4,RTN4)抗原基因,对其序列进行生物信息学分析。【方法】采集感染Eg的绵羊肝脏和肺脏,提取Eg头节总RNA为模板,对RTN4基因进行RT-PCR扩增,将PCR产物克隆到pMD19-T载体后测序,对其核苷酸序列及氨基酸序列进行生物信息学分析。【结果】Eg RTN4cDNA全长654bp,编码217个氨基酸,蛋白质分子质量为25.3ku,等电点为8.83。编码氨基酸序列中含有1个N端酰基化位点、2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和4个蛋白激酶C磷酸化位点。经生物信息学软件预测,RTN4蛋白的抗原表位区主要集中在第1-47位、第71-147位和第171-217位区域;含有2个高度疏水区,2个跨膜区,膜外区分别位于第1-47位和第171-217位。【结论】成功克隆了Eg RTN4基因,预测了其编码蛋白抗原的结构和表位。     

少孢节丛孢菌胞外几丁质酶AO-379基因克隆及其表达分析

【目的】深入了解捕食线虫性真菌几丁质酶的生物学功能,为今后以少孢节丛孢菌重组几丁质酶AO-379研发线虫病生物防控制剂打下基础。【方法】克隆少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶AO-379基因的全长序列,利用Signal P4.1 Server、Inter Pro、Ex PASy等在线分析软件对其进行生物信息学分析;构建重组表达载体p ET32a-AO-379,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后用IPTG进行诱导表达,并以SDS-PAGE和Western blotting检测分析表达获得的融合蛋白。【结果】少孢节丛孢菌几丁质酶AO-379基因全长1475 bp,含有1个1203 bp的开放阅读框(ORF),编码400个氨基酸。几丁质酶AO-379基因序列与少孢节丛孢菌标准株(ATCC 24927)几丁质酶基因序列的同源性为97.08%,其推导氨基酸的同源性为98.75%。几丁质酶A0-379属于糖苷水解酶18家族,具有SXGG和VDGFDLDFE两个催化区保守序列。其中,SLGGS位于第127~131位,为底物结合位点;VDGFDLDFE位于第173~181位,为水解酶催化活性位点。经大肠杆菌诱导表达获得的融合蛋白AO-379相对分子质量为60.0 kD,且能与抗少孢节丛孢菌多克隆抗体发生反应。【结论】少孢节丛孢菌几丁质酶AO-379可在大肠杆菌中成功诱导表达,且获得的融合蛋白AO-379能与抗少孢节丛孢菌多克隆抗体发生反应,可用于研发线虫病生物防控制剂。     

不同保存方法对少孢节丛孢菌存活及捕食活性的影响

为了探讨少孢节丛孢菌分生孢子及菌丝长期保存方法,以分生孢子萌发、菌丝生长、产生捕食器和捕食能力为指标,比较少孢节丛孢菌分生孢子及菌丝在不同保存条件下的保存效果。结果表明,在3种保存溶液中、-20℃条件下冻存3a的分生孢子没有萌发长出菌丝,而在4℃条件下保存3a的分生孢子仍可以萌发长出菌丝,且能产生捕食器捕食线虫。在固体培养基CMA和YPSSA生长的菌丝于-20℃或4℃条件下保存2a,菌丝仍可生长并产生捕食器捕食线虫;但在-20℃保存2a的菌丝复苏后接种对绵羊粪便中线虫的捕食活性较冻存前有所下降。研究结果提示,少孢节丛孢菌分生孢子可在3种保存溶液中4℃条件下及在固体培养基CMA、YPSSA中于-20℃或4℃条件下均可长期保存,但在3种保存溶液中4℃条件下菌株的捕食活性最高。