大黄鱼血清IgM纯化及其兔抗血清的制备

分别用饱和硫酸铵二次盐析法和蛋白A亲和层析法对健康大黄鱼（Pseudosciaena crocea）血清中的免疫球蛋白（IgM）进行分离纯化,所得产物用SDS-PAGE进行检测.结果表明,蛋白A亲和层析法可以较好地分离到高纯度的大黄鱼血清IgM,产物的电泳胶中只有重链和轻链2个条带;饱和硫酸铵二次盐析法除了有这2个条带,还有很多杂带,而且蛋白A亲和层析法更为简便、快速,因此用蛋白A亲和层析法分离纯化IgM优于饱和硫酸铵二次盐析法;大黄鱼免疫球蛋白重链的分子量在76 kD左右;轻链分子量在28 kD左右.用纯化的大黄鱼IgM免疫实验兔,获得效价高达1：40 960的兔抗鱼IgM血清.本实验所建立的蛋白A亲和层析法提取大黄鱼血清IgM可以方便、快捷地获得高纯度的产物,适合在实验室中纯化鱼类IgM.本研究所制备的兔抗大黄鱼IgM血清可为今后的相关研究工作打下基础.[中国水产科学,2006,13（3）：475-479]  

不同环境条件对溶藻弧菌粘附大黄鱼肠粘液的影响

研究了不同环境条件下溶藻弧菌对大黄鱼肠粘液的粘附作用。采用细菌计数法测定溶藻弧菌的粘附作用。粘附的细菌经SYBR GreenⅠ染色后在荧光显微镜下观察，用数码相机拍照后在电脑上计数。试验结果表明，溶藻弧菌对大黄鱼肠粘液的粘附量随菌浓度的升高而升高，并在1—1．5h内趋于饱和；粘附作用在15—30℃、pH偏酸时较强；盐度在5—35范围内对前肠粘液的粘附作用影响不明显，后肠粘液的粘附作用在此范围内随盐度增大而加强，在盐度为0时，溶藻弧菌对前、后肠粘液都无粘附作用；56℃热处理5min及60℃处理1h均能大幅减弱溶藻弧菌对两种肠粘液的粘附作用，表明溶藻弧菌表面的某些热敏结构在粘附作用中起着重要作用。根据以上结果，可以认为溶藻弧菌能够很好地粘附于大黄鱼肠粘液层，其粘附作用受温度、盐度、pH值等环境因子影响很大，溶藻弧菌表面的某些热敏结构可能在粘附过程中起着重要作用。研究结果表明，溶藻弧菌对大黄鱼肠粘液的粘附作用是可控制的，这对于鱼类养殖疾病的控制有一定的参考价值。  

人工感染溶藻弧菌对大黄鱼免疫功能的影响

为了解大黄鱼在抗溶藻弧菌感染时免疫功能的变化规律，将160尾健康大黄鱼分为感染组和对照组，通过腹腔分别注射0.2 mL浓度为2×107 CFU·mL-1的溶藻弧菌和灭菌生理盐水，在注射0，1，3，7，11，15，19 d后从两组各取6尾大黄鱼，尾静脉取血，进行外周血的血相、NBT阳性细胞数、血清抗菌活力、抗体效价等免疫学指标的测定。结果显示：在人工感染的初期，感染组大黄鱼外周血的红细胞、白细胞、淋巴细胞和NBT阳性细胞的数量及血清抗菌活力等指标均较对照组有显著提高；在注射后1 d外周血粒细胞的数量显著低于对照组；抗体效价在7 d开始增加，15 d达到峰值，且用间接ELISA和试管凝集两种方法所得结果具有非常高的同步性。结果表明：在感染溶藻弧菌后，大黄鱼能通过红细胞和白细胞增殖、释放抗菌物质、产生特异性抗体等方式提高其对溶藻弧菌的免疫力；在感染的早期阶段非特异性免疫因子起主要作用，在感染后期阶段特异性免疫因子起重要作用；NBT阳性细胞数可以作为细菌感染的指标。图2表1参24  

日本对虾抗白斑病子三代的抗白斑综合征病毒感染能力及免疫特性

为了更好地进行日本对虾抗病良种的选育,本文用浓度为每毫升1×105个病毒粒子的对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)粗提液注射感染抗白斑病日本对虾子三代和普通日本对虾,观察其死亡率,同时测定WSSV感染后0,4,24,48和96 h血淋巴酚氧化酶(PO)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)活力和蛋白含量.结果显示:注射WSSV 14 d内抗病子三代和普通对虾的平均死亡率分别为15%和85%,前者的抗病保护率达82.4%;感染前前者的各项免疫指标均高于后者,且PO,AKP和蛋白含量存在极显著差异(P＜0.01);感染后两者血淋巴检测的5项指标在96 h内的变化趋势基本相似,除ACP以外,抗病子三代的其他指标都比普通日本对虾的高.研究结果表明,所选育的抗白斑病日本对虾子三代能够有效地抵抗对虾白斑综合征病毒的侵染,其免疫指标也高于普通日本对虾.  

大黄鱼冰鲜杂鱼饲料中细菌多样性研究

为研究大黄鱼（Larimichthys crocea）冰鲜杂鱼饲料中细菌的多样性，用细菌通用引物构建了细菌16S rRNA基因克隆文库。从文库中随机挑选125个克隆子进行限制性片段长度多态性（ RFLP）分析，得到82个不同的RFLP 带型。对部分代表性克隆子进行测序，得到23条有效序列。序列同源性分析和系统进化分析结果表明，大黄鱼冰鲜杂鱼饲料中细菌主要分为3大类群，其中γ-变形菌纲（γ-Proteobacteria）细菌占据明显地优势地位，约占所分析克隆子数的84.4％；其次是黄杆菌纲（Flavobacteria）细菌，约占10.9％；还有少量的梭杆菌纲（Fusobac-teria）细菌，约占4.7％。γ-变形菌纲细菌中以嗜冷杆菌（Psychrobacter sp.）最多，其次是发光杆菌（Photobacteri-um）。  

小球藻锌结合类金属硫蛋白的结构表征及抗菌活性

小球藻经60μmol/L的锌胁迫培养5d后,离心收集藻泥,经超声波细胞破碎后,离心得到上清液即蛋白质粗提液,再经葡聚糖凝胶层析柱G-75及脱盐柱G-25分离、纯化后,收集的蛋白组分经真空冷冻干燥后获得小球藻锌结合蛋白。通过Tricine-SDS-PAGE电泳、氨基酸组成及紫外光谱等方法进行表征,测得该蛋白的分子量约为8.2ku,半胱氨酸含量为15.4%,具有金属硫蛋白典型的紫外光谱特征,称为类金属硫蛋白(Zn-MT-like proteins)。试验采用琼脂糖孔穴扩散法,研究了小球藻Zn-MT-like蛋白对3种细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌)和3种真菌(青霉菌、曲霉菌、酵母菌)的抗菌活性,并与兔肝Zn-MTs的抗菌能力进行比较。结果表明,小球藻Zn-MT-like蛋白对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌)和霉菌(青霉、曲霉)具有显著的抗菌活性,1mg/mL的Zn-MT-like蛋白对金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、青霉和曲霉的抑菌圈直径分别为13.2、17.4、7.2和9.8mm;而对大肠杆菌、酵母菌则无抗菌活性。同样条件下,未加锌胁迫的小球藻蛋白质本身和兔肝Zn-MTs并不具有这些抗菌...  

河流弧菌对牙鲆表皮粘液的趋化作用

病原菌对粘液的趋化作用在其对粘液层定植过程中起着重要作用，趋化作用是病原菌的毒力机制之一。为了解病原性河流弧菌对牙鲆表皮粘液的趋化作用，本文采用改良的毛细管法研究了细菌浓度、孵育时间、孵育温度、pH值、NaCl浓度、碳水化合物等对河流弧菌趋化作用的影响。试验结果表明：在较低浓度下，河流弧菌对牙鲆表皮粘液的趋化量随着菌浓度的升高而增大；在室温下河流弧菌的趋化量随着孵育时间的延长而增加，60 min趋于饱和；孵育温度在4～15 ℃范围内趋化作用随温度升高而增强，15 ℃时达最大值；pH值为8时细菌的趋化性最强；NaCl浓度超过0.8 %,河流弧菌的趋化性随着浓度升高而显著减弱（P<0.05）；7种碳水化合物中甘露醇、乳糖、甘露糖能够极显著地促进河流弧菌对牙鲆表皮粘液的趋化作用（P<0.01）。以上结果说明：牙鲆表皮粘液对河流弧菌有较强的趋化作用，该趋化作用受环境因子的影响较大；本文所揭示的河流弧菌趋化特性将对养殖牙鲆疾病防治提供有价值的参考。  

中国沿海光裸方格星虫6个地理群体遗传多样性分析

为科学保护和开发我国光裸方格星虫自然资源，本研究以cytb基因全长为分子标记分析了山东烟台、福建古雷、香港、海南儋州、海南陵水、广西东兴6个光裸方格星虫群体的遗传多样性。结果显示，203个个体共检出128个单倍型，299个多态位点，核苷酸多样性和单倍型多样性分别为0.0488和0.9773，且变异主要来自群体间（88.4%）。6个光裸方格星虫群体间遗传分化指数（F_st）分析结果显示，南方5个群体间F_st<0.15，基本无分化或呈低度分化；而烟台与南方5个群体间的固定指数都很大，F_st>0.15，群体间呈高度分化。中性检验（Fu’s Fs、Tajima’s D）结果为负值，北方群体和南方群体的核苷酸错配分布图为单峰，单倍型网络分布图为以主单倍型为中心的放射状结构。用203条cytb序列构建的系统发育树显示，烟台群体聚为一个进化支，南方群体聚为一个进化支。研究表明，中国沿海的光裸方格星虫群体在历史上经历过大规模群体扩张，但目前遗传多样性较低，说明光裸方格星虫对环境变化的适应能力较差，应加强野生资源的保护，在进化关系上，烟台群体与其他5个群体之间存在较大的遗传分化，但是否已经形成隐秘种仍需进一步的研究。  

美洲鳗鲡及其养殖水体分离耐药菌的多样性和耐药性分析

为了更有针对性地防控水产动物细菌性病害的发生和流行,本实验对美洲鳗鲡及其养殖水体耐药细菌的种属特征及耐药情况开展了相关研究。首先采集美洲鳗鲡不同部位(表皮、鳃、肠道)及其养殖水体的样品,经5种抗菌药物平板筛选耐药菌株,然后采用K-B纸片扩散法检测细菌对抗菌药物的耐药性,同时测定耐药菌株的16S rDNA序列,进而分析耐药菌的种属分布和多重耐药性。结果显示,经耐药平板筛选分离纯化得到108株细菌,分别属于气单胞菌属、柠檬酸杆菌属、不动杆菌属等20个属;其中,93.5%的菌株对3种(含)以上的抗菌药物具有耐药性,86.1%的菌株对3类(含)以上的药物具有抗性。对阿莫西林的耐药率高达90.7%,对四环素、利福平以及磺胺类和酰胺醇类药物类的耐药率为60%~80%,对头孢噻肟、新霉素以及喹诺酮类的耐药性弱(低于20%)。美洲鳗鲡肠道(0.40)、表皮(0.41)、鳃部(0.42)及水样(0.47)菌群的多重耐药指数显示各生态样品耐药程度较为严重,尤以水样为最。各菌属中,柠檬酸杆菌属(0.58)和克雷伯菌属(0.61)的多重耐药指数最高,而不动杆菌属(0.21)则相对较低。美洲鳗鲡及养殖水体普遍存在多重耐药菌株,对此应引起足够的重视;水产动物及养殖环境耐药细菌对某些水产用药如诺氟沙星、新霉素等耐药率低,可将其做为水产动物细菌性疾病治疗的首选药物。  

基于核酸适配体的PCR法检测溶藻弧菌及其灭活菌

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)分布广,数量多,发病率高,是水产养殖中常见的条件致病菌,而对溶藻弧菌进行快速准确的识别鉴定是其病害防治的前提和基础。核酸适配体,因为具有较高的亲和特异性,在微生物的识别鉴定方面展现出了巨大的优势。本文利用核酸适配体和适配体筛选产物,通过结合、洗涤、加热分离、PCR扩增以及电泳检测等步骤,对溶藻弧菌进行了检测鉴定。结果表明,适配体和筛选产物都能对溶藻弧菌及其灭活菌进行较好的识别鉴定,适配体筛选产物对溶藻弧菌的检测下限为10~3cfu/mL,而对其灭活菌的检测下限为10~2cfu/mL,适配体对溶藻弧菌及其灭活菌的检测下限都可达到10 cfu/mL。该方法对溶藻弧菌有较好的亲和特异性,并能较好地区分溶藻弧菌与哈维氏弧菌等水产常见病原菌,在水产病害的检测中显示了较好的应用前景。