两种泥鳅不同群体遗传变异的 RAPD 分析

本文系统介绍了鱼类性别特异分子标记筛选的研究历程、分子标记辅助性控育种的研究进展及展望。首先,作者回顾了我国鱼类性别特异分子标记的研究历程,包括探索期 (2001—2006年),突破期 (2007—2012年)和快速发展期 (2013—2023),其中在突破期重点描述了半滑舌鳎、黄颡鱼等性别特异分子标记的发现,为我国鱼类性别决定机制研究和性控育种提供了重要技术手段。其次介绍了分子标记辅助性控育种的研究进展,采用性别特异分子标记辅助培育出半滑舌鳎“鳎优1号”,黄颡鱼“全雄1号”、“全雄 2号”等新品种,极大的推动了我国鱼类性别控制育种研究工作。最后,文章对我国鱼类性别特异分子标记筛选和分子标记辅助性控育种的未来发展方向进行了展望,提出今后应从持续开发养殖鱼类性别特异分子标记、强化鱼类性别特异分子标记筛选方法创新、优化鱼类性别特异标记的应用方法等方面加强鱼类分子标记辅助性控育种的研究。

     

Cyclin-CDK-CKI及UPP参与生殖调控及在甲壳动物性腺发育中的研究进展

泛素-蛋白酶体系统作为重要的蛋白质修饰途径,参与多个生物学过程,其中泛素结合酶E2作为关键酶可以决定泛素化对靶蛋白的影响。为了探究泛素结合酶E2在半滑舌鳎雌性性腺发育中的作用,本研究克隆了半滑舌鳎Cs-UBE2D4基因的开放阅读框ORF,检测了该基因在不同组织和不同发育阶段性腺中的表达模式;构建了其启动子报告基因载体(pGL3-Cs-UBE2D4)并进行了启动子活性分析。Cs-UBE2D4开放阅读框为360 bp,编码119个氨基酸,含有保守的泛素结合酶E2结构域。荧光定量PCR结果显示,Cs-UBE2D4在雌鱼的各组织中广泛表达,其中在卵巢和肝脏中表达量较高,而在雄鱼中几乎检测不到表达;在卵巢各发育阶段中,该基因的表达量从90日龄开始上调,6月龄达到峰值,之后开始下调,在1.5龄时表达量最低,在3龄时表达量有所回升,其中6月龄表达量为90日龄表达量的1.97倍。双荧光素酶活性检测结果显示,Cs-UBE2D4启动子具有较强的转录活性。本实验将为进一步开展Cs-UBE2D4基因对半滑舌鳎卵巢发育和性别调控相关机制的研究提供理论依据。     

利用显微注射技术冷冻保存牙鲆胚胎

在鱼类胚胎的冷冻保存中,需要抗冻剂有效地渗入胚胎,才能对胚胎起到保护作用.本研究采用显微注射技术将抗冻剂直接注射到牙鲆(Paralichthys olivaceus)胚胎内,以实现牙鲆胚胎的玻璃化低温冷冻保存.研究中,首先对抗冻剂种类进行了选择,将抗冻剂的毒性由大到小依次排列为:乙二醇(EG)、甘油(Gly)、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇(MeOH)、1,2丙二醇(PG)、PM21(PG:MeOH=2:1);对胚胎发育时期和注射剂量进行了筛选.实验结果显示,注射600pL(1 pL=10-6mL)抗冻剂PM21后,牙鲆的心跳期胚胎成活率显著高于尾芽期胚胎(P＜0.05),成活率为(64.04 2.05)%;对卵黄囊、卵膜与卵黄膜间隙作为注射部位进行了选择,发现采用卵黄囊内注射的胚胎成活率高于"五步平衡法",并显著高于通过卵黄膜间隙注射(P＜0.05),其成活率为(44.24±7.88)%.结果表明,注射600pL 35%PM21至牙鲆心跳期胚胎卵黄囊内,平衡10min,然后进行玻璃化冷冻保存,取得了68.2y.4%透明胚胎,能够对牙鲆胚胎提供很好的保护.说明显微注射方法可以成功地将抗冻剂注射入牙鲆胚胎,并在牙鲆胚胎的冷冻及胚胎的完整性方面发挥有效的保护作用.     

牙鲆肌肉生长抑制素(MSTN)基因克隆

采用同源克隆及基因组步移的方法,分离克隆了牙鲆肌肉生长抑制素(MSTN)基因.经过序列分析及cDNA验证,牙鲆MSTN基因具有3个外显子和2个内含子,编码377个氨基酸.5'侧翼区含有8个TATA框,一个CAAT框,6个E框;3'侧翼区含有加尾信号.通过同源分析,牙鲆MSTN C末端含有9个保守半胱氨酸残基和一个RVRR蛋白酶酶切位点;通过进化树分析,牙鲆MSTN与鱼类MSTN基因聚为一支.RT-PCR分析表明,牙鲆MSTN在胚胎发育中不表达或表达量较低,说明MSTN在牙鲆胚胎发育中并不起重要作用;其在各组织中的表达,随个体和环境的不同而有差异,暗示MSTN的表达受外界因素调控.     

土壤有机质光谱响应特性研究

土壤有机质光谱响应特性研究是光学遥感定量化的基础性研究.研究利用VF991地物光谱测量仪对八个不同环境条件下形成的土壤样本剖面上的各个土层进行光谱测量,得到各个土层的反射率光谱曲线,并测出各个土层的有机质含量.通过研究土壤的有机质含量与土壤反射光谱间的相关性分析,发现有机质含量与土壤光谱在紫外区的376.795nm波段、可见光区的616.506nm波段和近红外区的724.0975nm波段附近有较好的负相关性     

牙鲆抗菌肽hepcidin基因在成鱼组织和不同发育时期胚胎中的表达分析

抗菌肽hepcidin是由hepcidin基因编码产生的小分子多肽,是机体天然免疫的重要因子。本文利用RT-PCR的方法分析表明,抗菌肽hepcidin基因在牙鲆成鱼不同组织和不同发育时期胚胎中普遍表达,但是表达水平存在着明显的差异。     

基于转录组测序的半滑舌鳎长链非编码RNA的初步鉴定与分析

以抗病家系与易感家系半滑舌鳎为材料,进行哈维弧菌感染实验,并对易感家系感染前(CsSU)、易感家系感染后(CsSC)、抗病家系感染前(CsRU)、抗病家系感染后(CsRC)4组进行转录组测序,根据RNA-seq数据挖掘半滑舌鳎长链非编码RNA信息;通过生物信息学分析,筛选出与抗哈维弧菌病相关的差异长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)。结果显示,共识别出4 584个lncRNA座位,包含5 714个转录本;其基本特征与编码基因的比较分析,lncRNA的GC含量低于编码基因,单外显子基因数多于编码基因,转录本的平均长度长于编码基因,基因表达量低于编码基因。对4组样品进行两两比较(CsRU vs CsSU、CsRC vs CsSC、CsRC vs CsRU、CsSC vs CsSU)分别筛选出818、813、261、140个差异表达lncRNA,其中CsRU与CsSU之间、CsRC与CsSC之间lncRNA数目差异最多,通过聚类分析确定了各实验组的表达模式之间的联系,CsRU与CsSU之间的表达模式最为相近。通过共表达分析,预测出lncRNA和274个编码基因可能存在14 539种相互关系,并进行了功能注释,进而筛选出7个关键lncRNA。qRT-PCR结果显示,差异表达lncRNAs的表达模式和转录组数据得到的基本一致。研究结果为揭示lncRNA在半滑舌鳎抗哈维弧菌免疫调控反应中的作用提供重要的参考数据。     

半滑舌鳎StAR基因克隆及其在不同组织的时空表达分析

利用半滑舌鳎性腺转录组测序获得的StAR基因部分序列,设计RACE引物,克隆了半滑舌鳎StAR基因的cDNA序列,全长为1 294 bp,5'端UTR为132 bp,3'端UTR为310 bp,开放阅读框(ORF)为852 bp,共编码283个氨基酸。将半滑舌鳎StAR基因与其他物种StAR基因进行氨基酸同源性分析,结果显示,半滑舌鳎StAR与塞内加尔鳎、大口黑鲈、花鲈、金头鲷的同源性都达到了85%,与虹鳟、斜带石斑鱼及日本鳗鲡的同源性分别为81%、83%和76%。雌、雄鱼不同组织StAR基因的表达分析表明,StAR基因在雄鱼性腺中高表达,在雄鱼的肝脏、脑及心脏中表达量较低,而在雄鱼的其他组织中不表达;在雌鱼肠中不表达,在其他组织(卵巢、肝脏、脾脏、脑、垂体、肌肉、心脏、肾脏)中微量表达。荧光定量PCR分析不同组织与不同时期性腺表达谱表明,雄鱼性腺中StAR基因的表达量显著高于雌、雄鱼其他各组织(P0.05),提示StAR基因对雄鱼精巢发育起重要作用。雄鱼不同时期表达谱分析结果显示,StAR基因在66天前的精巢中不表达,在150天时表达量急剧增加,至2龄时表达量最高,3龄时表达量下降,说明该基因在精巢发育成熟过程中起重要作用。原位杂交结果显示,StAR基因主要在雄鱼精巢的精子细胞中表达,而在雌鱼的卵巢中不表达。研究表明,StAR基因在半滑舌鳎精巢发育中发挥作用,且可能在精子形成中发挥重要作用。     

大菱鲆MKK基因家族全基因组鉴定及其在生物和非生物应激下的表达分析

为了阐明大菱鲆丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinases,MAPKKs或MKKs)基因家族在生物和非生物应激响应中的作用,本实验首先通过生物信息学方法对大菱鲆MKK基因家族进行了全基因组水平的鉴定,利用多个应激相关转录组数据集分析了大菱鲆MKK家族成员在不同组织及不同生物和非生物应激下的表达模式。结果显示,本研究在大菱鲆全基因组水平上共鉴定出9个MKK基因家族成员,它们不均匀地分布在7条染色体上,并分别对其编码蛋白的理化性质、蛋白二级结构和亚细胞定位进行了预测。基于系统发育分析,将SmMKKs划分为5个亚家族。内含-外显子结构、保守基序和多重序列比对分析结果不仅为大菱鲆MKK亚家族分类提供了证据,而且表明SmMKKs在进化上高度保守。SmMKKs在不同组织及不同生物和非生物应激下的基因表达模式分析表明,SmMKKs具有明显的组织特异性表达。另外,结果显示,粘孢子虫和肿大细胞病毒感染后,SmMKK6a呈极显著差异表达;热应激处理后,SmMKK6a呈极显著差异表达;高盐或低盐胁迫后,SmMKK4a、SmMKK4b、SmMKK6a...     

齐口裂腹鱼鳃丝细胞系的建立、鉴定及免疫研究

齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)是长江上游水域的珍稀鱼类, 近年来由于环境变化和疾病爆发野外齐口裂腹鱼数量急剧减少, 现已被列入长江上游二级急切保护的特有鱼类, 因此, 对齐口裂腹鱼的保护刻不容缓。建立齐口裂腹鱼细胞系是保护其种质资源的有效手段, 也可以在不伤害现有鱼群的条件下进行多种齐口裂腹鱼相关生物学研究。本研究建立了首个来源于齐口裂腹鱼的细胞系, SPG 细胞系。原代细胞分离自齐口裂腹鱼鳃丝组织, 呈均一的上皮状, 使用含 15%血清的 L-15 培养, 在 15 个月时间里成功传至 55 代。线粒体 COI 基因鉴定, 证明该细胞来源于齐口裂腹鱼, 核型检测细胞染色体数目为 2n=96。在液氮中保存 12 个月的细胞, 复苏后能保持 75%以上活力。EGFP-N3 质粒转染 SPG 细胞后观察到明显的绿色荧光蛋白表达。病毒类似物 poly(I:C)和大肠杆菌脂多糖 LPS 可引起细胞 IL-1β、IL-8、TNFa 和 TLR22 等免疫相关基因表达量升高。表明本研究建立的齐口裂腹鱼鳃丝细胞系可用于免疫学研究。此外, 此细胞系还将在种质保存, 外源蛋白表达和齐口裂腹鱼体外生物学研究中发挥重要作用。