草鱼出血病分子流行病学及GCRV多样性研究

[目的]分析不同基因型GCRV分离株与患草鱼出血病草鱼症状的相关性。[方法]采用RT-PCR检测患病草鱼,应用生物信息学方法分析基因型内和基因型间不同分离株间的差异。[结果]对近3年来草鱼出血病分子流行病学分析发现,患草鱼出血病病鱼多为"肠炎型"症状,且检测发现其病原多属于GCRV基因型Ⅲ型。对GCRV的多样性分析表明,不同分离株同源蛋白的同源率高达93%以上,却被给予完全不同的名称,给GCRV多样性研究带来一定的困难;同一基因型不同分离株同源蛋白间的变异位点较少,且功能位点发生变异的更少;不同基因型不同分离株同源蛋白间的保守位点较少,且这些保守位点中只有极少数位点为功能位点;不同基因型分离株同源结构蛋白间存在较大的差异,且同源非结构蛋白间的差异更为显著。[结论]草鱼出血病不同临床症状可能与其病原基因型不同有关。     

五倍子和石榴皮对溶藻弧菌及其生物膜的体外抑制作用

[目的]明确五倍子(Rhus chinenis)、石榴皮(Folium sennae)对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)及其生物膜的体外抑制作用。[方法]采用琼脂扩散法,分别测定五倍子、石榴皮对溶藻弧菌的体外抑菌作用;选用倍比稀释法确定五倍子、石榴皮对溶藻弧菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC);采用改良微孔板法评价2种中草药液对溶藻弧菌生物膜形成的影响。[结果]2种中草药都有不同程度的抑制溶藻弧菌的作用,五倍子对溶藻弧菌的抑菌圈直径为(16.37±0.14)mm,MIC和MBC均为6.25 mg/m L;石榴皮对溶藻弧菌的抑菌圈直径为(12.37±0.06)mm,MIC和MBC分别为12.50、25.00 mg/m L。当药物浓度在1.56 mg/m L及以上时,五倍子对溶藻弧菌生物膜的形成有极显著抑制作用;药物浓度在6.25 mg/m L及以上时,石榴皮对溶藻弧菌生物膜的形成有极显著抑制作用。[结论]五倍子和石榴皮对溶藻弧菌及其生物膜均有抑制作用。     

地高辛标记的DNA探针制备及其应用于溶藻弧菌的检测

从基因库中获取溶藻弧菌的胶原蛋白酶基因序列和外膜蛋白基因序列,根据基因的保守性用DNAStar分别设计2对引物,分别对溶藻弧菌基因组进行PCR扩增,用地高辛标记扩增的特异DNA片段以制备探针.分别用胶原蛋白酶DNA探针和外膜蛋白DNA探针对实验室保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌进行斑点杂交检测,检测结果表明,胶原蛋白酶基因探针与保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌DNA产生较强的阳性反应,而与霍乱弧菌、哈氏弧菌和副溶血弧菌DNA等均无反应,表明该胶原蛋白酶DNA探针的特异性较强;而外膜蛋白基因探针与保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌DNA产生较强的阳性反应,但与哈氏弧菌和副溶血弧菌DNA也出现了较强的阳性反应,与霍乱弧菌DNA则无反应,表明该外膜蛋白DNA探针的特异性较低.说明所构建的溶藻弧菌胶原蛋白酶DNA探针斑点杂交检测方法具有特异性强、简便易行,可应用于溶藻弧菌的快速检测.     

鰤鱼诺卡氏菌培养条件及培养基的优化

对鰤鱼诺卡氏菌（Nocardia seriolea）ZJ0503的增菌培养基和生长条件进行优化。研究了温度、盐度、初始pH对鰤鱼诺卡氏菌生长的影响，并通过单因素试验对培养基的碳源、氮源和无机盐成分进行了筛选，采用正交实验法对培养基各主要成分的添加量进行了优化。结果表明，鰤鱼诺卡氏菌最适宜生长条件为温度25 ℃、盐度5、pH 6.5±0.2；经筛选，鰤鱼诺卡氏菌培养基中最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是酵母粉，促生长作用最强的2种无机盐是磷酸氢二钾（K2HPO4）和氯化钙（CaCl2）；确立了培养基优化配方为葡萄糖20 g·L-1，酵母粉15 g·L-1，K2HPO4 0.75 g·L-1，CaCl 20.2 g·L-1（单独灭菌），氯化钠（NaCl2）5 g·L-1，pH 6.5±0.2。     

鳙小卫星DNA的克隆

鳙基因组ＤＮＡ 经内切酶Ｓａｕ３ＡⅠ完全酶切后，与Ｂａｍ ＨⅠ－ ｐＵＣ１８ 质粒连接，转化ＤＨ５α后，获得９３３ 个重组体。用人源小卫星探针３３ ．１５ 对重组体进行原位杂交筛选，获得１４ 个阳性克隆，取其中的１ 个阳性克隆（ 即小卫星ｐＢＣ１７４） 作探针，与５ 尾鳙和４ 尾鲢基因组ＤＮＡ 杂交，能产生具有高度变异性的、个体特异性的ＤＮＡ 指纹图，表明克隆的鳙小卫星ｐＢＣ１７４ 可用于鱼类ＤＮＡ 指纹分析。     

吉富罗非鱼mIgD基因恒定区序列的原核表达及多克隆抗体的制备

实验采用原核表达方法成功获得吉富罗非鱼m Ig D基因恒定区融合蛋白,同时利用纯化的MIGD融合蛋白,制备了兔抗MIGD多克隆抗体。ELISA检测MIGD融合蛋白效价高达1∶512 000,说明MIGD蛋白具有较强的免疫原性,可以诱导罗非鱼机体产生相应较强的免疫应答。     

恩诺沙星对红笛鲷血清中碱性磷酸酶活力、抗体IgM含量、溶菌酶含量及其抗菌能力的影响

以间隔200mg／kg的恩诺沙星设置8个浓度梯度腹腔注射红笛鲷进行急性毒性实验，测得其安全浓度为67．56mg／kg，参考安全浓度及日常生产给药量取0、20、40、80mg／kg鱼体重恩诺沙星，以腹腔注射及拌料投喂两种不同给药方式，研究恩诺沙星在该浓度范围内对红笛鲷血清中一些免疫指标及其感染细菌后死亡率的影响。实验结果表明恩诺沙星在40m非g浓度组中提高AKP活力、IgM含量、溶菌酶含量的同时可提高红笛鲷抵抗外界细菌感染的能力（P〈0．05）。当用药浓度不足（20mg/kg组）或浓度过高（80mg／kg组），虽然对AKP活力和IgM含量也有影响，但在投喂组中，红笛鲷体内的IgM含量受抑制显著，经腹腔注射2．3×10^7 CFU／mL溶藻弧菌 （ Vibrio alginolyticus ）攻毒后，注射组中相对生理盐水组的死亡率55％；20、40、80mg／kg浓度组红笛鲷的死亡率分别为45％、30％、50％；投喂组中，0、20、40、80mg，kg浓度组红笛鲷的死亡率分别为55％、40％、30％、60％；40mg／kg浓度组中抗菌能力增强；20、80mg／kg浓度组中红笛鲷抗菌能力不受影响或有负面影响。     

五味子和黄精对副溶血弧菌及其生物膜的体外抑制作用

采用琼脂扩散法,分别测定五味子(Shisandra chinensis)、黄精(Polygonatum sibiricum)对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的体外抑菌作用;选用倍比稀释法确定五味子、黄精对副溶血弧菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC);采用改良微孔板法(MTT)评价两种中草药液对溶藻弧菌生物膜形成的影响。结果表明,两种中草药都有不同程度的抑制副溶血弧菌的作用,五味子对副溶血弧菌的抑菌圈直径为18.67(±0.2)mm,MIC为1.56 mg/m L,MBC为3.125 mg/m L;黄精的抑菌圈直径为11.26(±0.6)mm,MIC和MBC分别为1.56、3.125 mg/m L。当药物浓度达到3.125 mg/m L以上时,五味子和黄精对副溶血弧菌生物膜的形成有极显著抑制作用。     

中草药对建鲤非特异性免疫功能的影响

用添加中草药的鲤配合饲料饲喂建鲤(Cyprinnus var．Jian)后,测定了建鲤非特异性免疫指标。饲喂药饵Ⅰ 10、15、30 d后,氯化硝基四氮唑兰(NBT)阳性细胞数分别为 27±3．45、39±6．04和 38±4．81,溶菌酶活力分别为 0．013±0．0017、0．018±0．0053和 0．021±0．0037;饲喂药饵 Ⅱ 10、15、30 d后,NBT阳性细胞数分别为 30±2．23、87±8．57和82±7．42,溶菌酶活力分别为0．015±0．0020、0．044±0．0017和0．033±0．0011;而对照组NBT阳性细胞数分别为28±2．18、27±4．05和29±3．56,溶菌酶活力分别为0．013±0．0010、0．012±0．0031和0．015±0．0046。结果表明,饲喂药饵Ⅱ 15、30d后的NBT阳性细胞数和溶菌酶活力均显著高于对照组(P＜0．05)。因而,本配方的中草药按质量分数为1．0%的量加入到饲料中,既能明显提高建鲤的吞噬细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的数量,又能提高其溶菌酶的活力,从而明显提高建鲤的非特异性免疫能力。