基于荧光检测技术的多花黑麦草EST-SSR指纹图谱的构建

【目的】构建基于EST-SSR荧光标记的多花黑麦草(Lolium multiflorumLam.)DNA指纹鉴定体系,为多花黑麦草品种鉴定提供高通量技术手段,为不同品种的合理应用提供参考依据,有效保护农民利益和育种权益。【方法】利用表型性状差异大的3个品种(特高Tetragold、长江2号Changjiang No.2和阿伯德Aubade),通过聚丙烯酰胺凝胶电泳从200对EST-SSR引物中筛选出扩增条带清晰、多态性好、扩增稳定的30对引物。在筛选出的每对引物5′端添加荧光标记FAM后,采用毛细管法通过DNA分析仪检测200个单株不同等位变异的扩增片段,从30对EST-SSR引物中筛选出25对扩增稳定的荧光引物,建立基于高通量荧光SSR标记的多花黑麦草品种鉴定体系。【结果】通过25对EST-SSR引物构建的DNA指纹图谱来进行10个多花黑麦草材料的品种鉴定。25对EST-SSR引物共检测到127个等位基因,等位变异扩增片段长度范围为51—249 bp,每对引物可检测到有效等位基因数为2—11个,特异等位基因最多可检测到11个(N101),平均每对引物4.00个;多态性位点的比率范围为33.33%—100.00%。平均PIC值为0.702,Shannon指数最大为3.322(N101),平均为1.929,基因多样性指数变幅为0.159—0.500,平均0.318,可鉴别的材料数为0—10个;其中14对特征引物在10个品种(系)上可检测出25个特异等位基因。综合来看,引物N101在200对引物中鉴别效率最高,可直接将10个多花黑麦草品种(系)区分开,在长江2号、赣选1号和川农2号上同时检测出特异等位基因。但由于多花黑麦草在品种间与品种内变异均较高,因此为鉴定更多材料,从25对引物中选择了6对扩增和检测效果较好的引物(N54、N101、N146、N151、N154、N156),6对引物可检测到的稳定等位基因数均不小于19个,在达伯瑞和邦德上最多可检测到22个等位基因。通过6对高效引物构建了10个多花黑麦草品种(系)的DNA指纹图谱,包括标准模式图、图谱代码和图谱QR编码。首次利用EST-SSR荧光标记毛细管电泳检测,为10个多花黑麦草材料分别构建了唯一的指纹代码和QR编码。【结论】利用6对高效引物构建了多花黑麦草SSR高通量鉴定体系,其中荧光引物N101多态性最高,可直接鉴别10个多花黑麦草品种(系)。     

基于SSR标记的四倍体鸭茅遗传图谱加密

【目的】利用转录组测序开发的EST-SSR标记和鸭茅基因组调研测序开发的基因组SSR（genomic-SSR）标记,对已构建的四倍体鸭茅遗传图谱加密,为定位控制鸭茅重要农艺性状的QTL位点奠定基础。【方法】基于拟测交策略,以“楷模”（高杆、多分蘖、宽叶、早熟）和“01436”（矮秆、少分蘖、细叶、晚熟）作为亲本材料进行杂交,得到一个含有214株鸭茅材料的作图群体,利用亲本和随机选取的5个单株对574对EST-SSR标记和150对Genomic-SSR进行引物筛选,PCR产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后,将扩增条带清晰、在亲本之间存在差异且子代间存在分离的多态性引物用于亲本及群体扩增。将扩增结果按标记类型统计分析,对于亲本间存在差异的条带,按条带有无（有带计1,无带记0）对DNA扩增产物按进行统计,经卡方检验,将分离比例符合1﹕1（亲本基因型为Aaaa×aaaa或aaaa×Aaaa）和3﹕1（亲本基因型为Aaaa×Aaaa）的标记,用于遗传连锁图谱构建。符合作图要求的标记采用HighMap软件进行遗传图谱构建。【结果】最终筛选出符合要求的EST-SSR引物31对和Genomic-SSR引物17对,引物多态性分别为5.4%和11.3%,总的多态性为6.6%。对鸭茅214个作图群体单株及亲本DNA进行扩增,共得到169个多态性位点,其中EST-SSR101个,Genomic-SSR68个位点。169个标记位点经卡方检验分析表明,有89个标记符合孟德尔分离规律,标记可用率为52.7%,其中呈Aaaa×aaaa或aaaa×Aaaa分离类型的标记有79个,呈Aaaa×Aaaa的有10个,其余80个为偏分离标记。将SSR标记整合以前的标记信息,重新构建了一张包含2 551个标记,覆盖7个连锁群,总长度为758.4 cM的鸭茅高密度遗传图谱。加密后的图谱包含SNP标记4 187个,SSR标记84个,各连锁群标记数在166-709个,每个连锁群的平均标记数为364个,LG1包含最多标记数有709个,LG7标记数最少166个,各连锁群长度在60.28-147.09 cM,标记平均密度为0.19-0.76 cM,总的平均图距由原来的0.37 cM缩至0.3 cM,且由于标记密度的改变,各连锁群上标记分布的位置也发生较大变动。【结论】增加了部分SSR标记后,新构建了一张包含2 551个标记,覆盖7个连锁群总长度为758.4 cM的四倍体鸭茅遗传图谱,总长度增加42.63 cM,平均图距由0.37 cM缩至为0.3 cM。