生物技术实验室高效管理的探讨

高校院系偏科研型实验室主要承担教师的科研任务以及研究生、本科生的毕业论文实验和部分课程实验教学任务,因此在管理上显得更为复杂和繁琐。本文结合华南农业大学蚕学生物技术实验室多年的管理经验,提出了完善制度,开放管理;师生共管,责任到人;资源共享,收费维护的管理模式,并加强实验室主管老师的核心作用,探讨科研型实验室的节约而又高效的管理方法。     

昆虫先天免疫中的肽聚糖识别蛋白(PGRP)

昆虫缺乏获得性免疫,仅依靠先天免疫作为其防御机制。在昆虫的先天免疫中,肽聚糖识别蛋白(PGRP)起着重要作用。本文从PGRP的发现、分类及其在昆虫免疫反应中的作用几个方面加以阐述。PGRP可以分为两类:长型(L)和短型(S)。不同类型的肽聚糖识别蛋白功能也不同。通过对肽聚糖识别蛋白的研究,可进一步了解昆虫的先天免疫,为特种经济昆虫养殖中的疾病防治提供科学理论依据。     

黑腹果蝇抗真菌肽Drs及其同系物基因的原核表达与蛋白纯化研究

【目的】Drosomycin（Drs）是从黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中鉴定发现的对丝状真菌有广谱抗性的抗真菌肽因子,此外，在黑腹果蝇基因组中，还存在另外6条Drs同系物的基因序列，对它们推导的氨基酸序列具有与Drs相同的保守位点和CSαβ模体结构。为鉴定Drs及其6个同系物的抗性功能差异，研究其分子结构与功能的关系，需要对这些同系物基因进行克隆表达，获得有生物学活性的纯化样品。【方法】本文采用PCR分段互补合成的方法准确地获得了Drs同系物基因，并克隆至pET-3C载体上，转化到宿主菌E.coli Origami（DE3）中进行诱导表达，表达产物经阳离子CM SepharoseTM Fast Flow层析、凝胶过滤Sephacryl S-100 High Resolution层析和包涵体的复性及Sephadex G-25脱盐等纯化处理后，进行抑菌活性检测。【结果】经纯化的7个Drs同系物的短肽样品，除Drs-lI外，其它的Drs同系物样品对供试真菌水稻立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)均有较强的抑制作用。【结论】表明本研究中使用的纯化及复性方法对具有多个二硫键的小分子多肽是比较有效的。     

昆虫抗真菌肽基因的分泌型表达及活性鉴定

 【目的】黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)抗真菌肽Drosomycin (Drs)及其同系物Drosomycin-like C (Drs-lC)和斑腹刺螠蝽(Podisus maculiverntris)抗真菌肽Thanatin对丝状真菌具有广谱高效的抑杀作用。实现抗真菌肽基因在酵母中的高效分泌型表达，对探讨利用转基因酵母的发酵液直接进行果蔬、食品和农产品防腐保鲜的生物技术研发有重要意义。【方法】将Drosomycin基因（Drs）及其同系物基因Drs-lC和Thanatin基因分别与酵母分泌型表达载体pPICZαA重组，构建成重组表达质粒pPICZαA-Drs、pPICZαA-Drs-lC和pPICZαA–Thanatin。利用电转化将重组质粒转化毕赤酵母GS115，经表型筛选和PCR鉴定获得的重组毕赤酵母转化子，在甲醇诱导下进行抗真菌肽的分泌表达。【结果】3种抗真菌肽基因的酵母表达产物对6个供试真菌中的5个有明显的抑制作用，Thanatin同时对供试细菌有抗菌活性。【结论】Drs、Drs-lC和Thanatin抗真菌肽基因成功地转化毕赤酵母，并实现其分泌型表达。     

昆虫抗真菌肽研究的科学意义及其应用前景

昆虫抗真菌是近年来刚刚起步的一个新的研究方向，国外目前已发现6种昆虫抗真菌肽因子。国内华南农业大学蚕学分子生物学与生物技术实验室课题组在此方向也取得一些重要进展，初步发现13种昆虫可能含有新的昆虫抗真菌肽基因。对昆虫抗真菌肽及其基因的研究，将大大拓宽昆虫抗菌肽的生物技术应用前景。     

BmATG5蛋白作为分子开关调控家蚕细胞自噬和凋亡关系的研究进展

细胞自噬(autophagy)和凋亡(apoptosis)是昆虫蜕皮与变态发育过程中细胞死亡最主要的2种方式。家蚕(Bombyx mori)是鳞翅目的模式昆虫之一,有关细胞自噬和凋亡的研究也比较深入,包括细胞自噬和凋亡的形态特征、诱导信号和通路、对蚕体发育的影响、自噬相关蛋白的鉴定和功能等。前期研究揭示家蚕自噬相关蛋白Bm ATG5和Bm ATG6具有自噬与凋亡的分子开关功能,但它们调控细胞凋亡的具体机制至今不详。本文在简要综述昆虫及家蚕细胞自噬和凋亡研究的基础上,重点介绍了Bm ATG5调控细胞凋亡分子机制研究的最新进展,为深入揭示Bm ATG5的分子调控功能,以及其应用于鳞翅目害虫防治和家蚕变态发育调控的研究提供参考依据。     

家蚕中肠组织在变态发育不同时期的蛋白表达差异分析

分析了家蚕在变态期不同发育时段中肠组织蛋白表达差异的信息。SDS-PAGE电泳分析显示,从家蚕吐丝前1 d到化蛹72 h的中肠蛋白分离到相对明显的16条泳带,其中分子量约为30、45、70 kD的蛋白组分含量较大,且比较稳定,分子量约为50、60、62 kD的蛋白组分在不同时期存在着显著的表达差异。进而通过聚丙烯酰胺双向凝胶电泳分析,发现家蚕中肠组织蛋白的表达种类和差异蛋白数目的变化在化蛹1～3 d非常明显:蛋白表达种类的变化呈现2个高峰,分别为化蛹0 h和化蛹41 h;差异蛋白数目的变化呈现3个波峰,分别在吐丝98 h至化蛹0 h、化蛹30～41 h和化蛹41～58 h。在化蛹1～3 d,这种显著峰值变化的时期刚好与家蚕中肠组织发生旧肠壁细胞退化死亡和新生肠壁细胞分化增殖的盛期相吻合,从一个侧面反映了家蚕中肠组织在变态期活跃的发育进程。     

黑腹果蝇抗真菌肽基因Drs和Drs-lC在原核中的表达及抗菌活性的初步测定

对黑腹果蝇(Drosophila m elanogaster)抗真菌肽基因Drs和它的同系物基因Drs-lC在pET-21d载体中与T7.Tag标签序列进行了融合表达,并对融合表达产物进行Xa因子切割前后的抗菌活性测定。首先通过长引物PCR获得5′端带有Xa因子识别切割序列的Drs和Drs-lC,分别克隆至pET-21d表达载体上,然后转化E.coliO rigam i(DE3),筛选得到阳性克隆。以IPTG诱导目的基因与载体上的T7.Tag标签序列融合表达,将表达产物进行初步纯化后,以Xa因子进行切割处理,然后测定处理前后样品的抗菌活性。结果显示与T7.Tag标签序列融合表达的D rs、D rs-lC样品和经Xa因子切割后的样品对供试真菌黄色镰刀菌(Fusarium culm orum)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxs-porum)和粗糙脉孢菌(Neuropora crassa)均有明显的抑制作用。     

抗真菌肽Drosomycin在原核生物表达系统中的可溶性表达

广谱性抗真菌肽Drosomycin的成熟肽由44个氨基酸组成,其中8个半胱氨酸形成4对二硫键,结构复杂.在原核表达该蛋白时容易形成包涵体,不利于实际利用.本研究希望通过与转铁蛋白TF融合表达的方式提高其可溶性表达.首先以果蝇DNA为模板扩增目的基因Drs,克隆至pCold TF载体,转化进大肠杆菌BL21(DE3),通过IPTG诱导进行表达,利用SDS-PAGE及Western blot鉴定表达产物.结果表明重组表达质粒pCold TF-Drs构建成功,转化大肠杆菌后能正常表达,且目的产物为可溶性表达.这一结果为抗真菌肽Drosomycin实现生产上的利用奠定基础.     

家蚕中肠抗菌微生物的培养筛查

抗菌肽(Antibacterial peptide,AMP)又叫宿主防御肽(host defense peptides),普遍存在于真核和原核生物体内,参与机体的天然免疫.抗菌肽因为其显著的优点,成为替代抗生素研究的一个靶标.但是抗菌肽在应用过程中遇到了一个瓶颈问题,即原核表达系统表达蛋白的无活性及真核表达系统的不稳定性,这也制约了抗菌肽的工业化开发应用.因此,筛选自身能分泌抗菌肽的微生物,利用其自身性能稳定、易培养的优点来生产抗菌肽成为研究热点.本研究通过常规培养方法从家蚕中肠中筛选出好氧菌和兼性厌氧菌,通过观察菌落形态、细菌形态以及染色反应鉴别出不同的细菌.通过超声波破碎细胞提取细胞内容物,进行抑菌实验.结果显示中肠优势菌杆状和球状细菌的分泌蛋白对供试菌均无抑菌活性.