牦牛EPO基因部分片段的克隆测序及其分析

根据GenBank中牛EPO基因序列设计一对引物,对九龙牦牛、大通牦牛、巴州牦牛及三江黄牛EPO基因部分序列进行PCR扩增、克隆和测序。结果表明,获得的九龙牦牛、大通牦牛及巴州牦牛该基因部分片段大小均为1 444 bp,三江黄牛为1 427 bp;在EPO基因核苷酸水平上,大通牦牛与巴州牦牛、九龙牦牛、三江黄牛的同源性依次为99.9%、99.6%、99.2%,巴州牦牛与九龙牦牛、三江黄牛的同源性依次达99.5%、99.2%,九龙牦牛与三江黄牛同源性为99.4%;在氨基酸水平上,大通牦牛与巴州牦牛、九龙牦牛、三江黄牛同源性依次为100%、99.2%、99.2%,巴州牦牛与九龙牦牛、三江黄牛同源性均为99.2%,九龙牦牛与三江黄牛氨基酸序列同源性高达100%。NJ法构建的物种间系统进化树表明,大通牦牛与巴州牦牛先聚为一类,再与九龙牦牛聚为一类,最后与三江黄牛聚为一类。     

三个牦牛群体激素敏感脂肪酶（HSL）基因外显子Ⅰ的多态性

 【目的】探究激素敏感脂肪酶（HSL）基因在牦牛内的遗传多态性,为进一步揭示牦牛群体间遗传分化、开展牦牛肉质性状的关联分析以及HSL基因在牦牛物种中的定位、表达调控等研究提供依据。【方法】采用PCR-RFLP方法对九龙牦牛、麦洼牦牛和巴州牦牛共92头牦牛的HSL基因部分外显子I进行SmaI酶切多态性分析;统计基因频率、基因型频率大小,进行卡方（χ2）适合性、独立性检验,并计算纯合度、杂合度、有效等位基因数和多态信息含量等遗传多态参数。【结果】3个牦牛群体在HSL基因外显子I具有SmaI酶切多态性,在该酶切位点存在AA、AB和BB 3种基因型。3个牦牛群体均检测到AA和AB基因型,而BB基因型只在巴州牦牛中检测到。九龙牦牛和麦洼牦牛的AA基因型频率最高,而巴州牦牛AB基因型频率最高;A等位基因频率在3个牦牛群体中均高于B等位基因频率,为优势等位基因。适合性检验表明3个牦牛群体在该酶切位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态;独立性检验表明九龙牦牛与麦洼牦牛、巴州牦牛之间表现为差异显著（0.01＜P＜0.05）和差异极显著（P＜0.01）,而麦洼牦牛与巴州牦牛之间表现为差异不显著（P＞0.05）。测序分析表明,HSL基因外显子I第70位（从PCR产物测序片段的5′端计数）发生了单碱基突变（G→A）,并导致了编码氨基酸由甘氨酸（G）变为精氨酸（R）。【结论】牦牛在HSL基因外显子I内具有SmaI酶切多态性,其多态性是因所分析序列内一单碱基突变（G→A）所致,该碱基转换导致了氨基酸由甘氨酸（G）变为精氨酸（R）;在该酶切位点,九龙牦牛、麦洼牦牛和巴州牦牛均处于Hardy-Weinberg平衡状态。九龙牦牛与麦洼牦牛、巴州牦牛之间表现为差异显著（0.01＜P＜0.05）和差异极显著（P＜0.01）,而麦洼牦牛与巴州牦牛之间表现为差异不显著（P＞0.05）。     

牦牛EPO基因的PCR-SSCP多态性研究

以巴州牦牛、大通牦牛和九龙牦牛为对象,对促红细胞生成素(EPO)基因用PCR-SSCP方法进行了多态性检测。结果表明:大通牦牛、巴州牦牛、九龙牦牛具有较丰富的遗传多样性,表现为AA,AB和BB3种基因型,AB为优势基因型,A为优势等位基因;经χ2适合性检验,3个牦牛品种在该基因位点上均处于Hardy-Weinberg平衡状态。同时发现随着海拔高度的增加,A等位基因频率逐渐升高,BB型的频率则降低,群体杂合度和多态信息含量也逐渐降低,这种变化可能与牦牛对低氧的适应能力有一定的关系。     

4个牦牛品种的RAPD遗传多样性研究

研究采用RAPD分子标记技术对麦洼、九龙、大通和天祝白牦牛等4个牦牛品种共124头牦牛进行了遗传多样性分析.结果表明:①每个RAPD引物扩增的DNA片段数在18～33个,且所有品种均表现多态,标记多态频率平均为38.63%,检测片断大小在0.25～5 kb之间;②用Shannon多样性指数公式计算牦牛品种的遗传多样性指数(H0),结果显示九龙、麦洼、大通、天祝白牦牛的遗传多样性指数分别为0.311、0.262、0.252和0.216;③采用Rogers遗传距离公式分析4个牦牛品种间的遗传距离(DR)结果:天祝白牦牛与九龙牦牛遗传距离最大(0.0414),与大通牦牛的距离最小(0.0383);④根据DR值,将4个牦牛品种聚为两大类,九龙牦牛聚为一类,其它3个牦牛品种聚为一类.大通牦牛和天祝白牦牛在较近的水平上首先聚为一类,然后与麦洼牦牛聚为一大类.     

大额牛Myf-5基因克隆、序列分析及其分子系统进化研究

对大额牛Myf-5基因进行PCR扩增、T—A克隆和序列分析，并应用DNAMAN4．0、BioEdit4．8．10、DnaSP4．10、Mega3．1等生物信息学软件同普通牛、黑猩猩、恒河猴、人、狗、家鼠、软体贝壳、鸡、斑马鱼9个物种相应基因编码区核苷酸序列和氨基酸序列进行了比对分析，在此基础上采用NJ、ME和UPGMA法对其编码区核苷酸序列构建了分子系统进化树。结果表明：①大额牛Myf-5基因由3个外显子和2个内含子组成，其大小分别为660、76、1226、852、407bp；外显子和内含子数与其他9个物种相同，但大小存在较大的差异；外显子与内含子连接区遵循GT—AG基因组成规则。②大额牛与普通牛、黑猩猩、恒河猴、人、狗、家鼠、软体贝壳、鸡、斑马鱼的Myf-5基因编码区核苷酸序列同源性分别为99．0％、90．0％、90．5％、90．5％、87．2％、84．8％、72．9％、64．3％、51．8％，相应的氨基酸序列同源性分别为99．6％、94．9％、94．6％、94．9％、89．9％、88．7％、81．6％、70．4％、56．6％，这说明大额牛与其他9个物种在Myf-5基因的编码区核苷酸和相应氨基酸序列上具有较高的保守性。③用NJ、ME和UPGMA等3种方法聚类构建的分子系统进化树表明，3种方法的聚类结果基本一致，即大额牛与普通牛首先聚为一类，人、黑猩猩、恒河猴也先聚为一类，这两类相聚后再依次同其他物种聚在一起。这与mtDNA、其他功能基因和动物学分类的研究结果一致，表明Myf-5基因适合用于物种间系统进化关系的研究。