脊尾白虾翻译控制肿瘤蛋白基因TCTP克隆及自噬调控相关基因在卵巢发育期的表达

为深入了解脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)卵巢发育和卵黄蛋白原发生的分子机制,本研究克隆得到脊尾白虾翻译控制肿瘤蛋白基因TCTP,并结合自噬调控基因TCTP、Hif-1α、Beclin1和Bcl-2在卵巢发育期的表达水平,阐释脊尾白虾卵黄蛋白原合成过程中的分子调控特征。研究显示,脊尾白虾TCTP基因c DNA全长为732 bp,编码168个氨基酸,具有典型的TCTP1和TCTP2功能域以及PKC和TKⅡ等mTOR信号通路相关的磷酸化位点。同时发现,甲壳动物TCTP普遍缺乏在其他动植物中高度保守的C末端的cys残基。进化分析显示,脊尾白虾TCTP与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)亲缘关系最近。4种自噬调控基因在脊尾白虾卵巢发育期的表达结果显示,肝胰腺TCTP基因从增殖期到产后恢复期呈递减趋势;肝胰腺Hif-1α、Beclin1和Bcl-2基因表达趋势相似,即从增殖期到小生长期高表达,大生长期极显著下降,表达量最低(P0.01),这与外源性卵黄蛋白原的合成趋势大致相反。这些自噬调控基因可能通过自噬作用共同调节外源性卵黄蛋白原的合成。卵巢TCTP基因在小生长期表达量最高;卵巢Hif-1α基因从增殖期到产后恢复期持续升高,这与内源性卵黄蛋白原表达趋势相似;卵巢Beclin1基因在大生长期表达量最高,与脊尾白虾卵巢Ec R表达趋势相似,与卵巢Bcl-2基因表达趋势相反,这些自噬调控基因可能通过自噬作用共同促进内源性卵黄蛋白的合成。本研究表明,自噬调控基因TCTP、Hif-1α、Beclin1和Bcl-2在脊尾白虾卵巢发育时期相互协调共同作用,可能通过自噬作用调节脊尾白虾卵黄蛋白原的合成和卵巢发育。     

脊尾白虾E75基因克隆及E75、ECR和RXR在不同蜕皮分期的表达分析

本研究在克隆脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)E75基因(EcE75,GenBank No.KY471317)的基础上,探讨了其在蜕皮过程中的作用,同时也探讨了克隆脊尾白虾的蜕皮激素受体基因(EcECR)和维甲酸X受体基因(Ec RXR)在不同蜕皮分期的表达特征。克隆的EcE75基因全长为3944 bp,包括2520 bp的开放阅读框(ORF)。该开放阅读框编码一个由839个氨基酸组成的蛋白质,分子量为92.307 k Da,理论等电点为7.48。EcE75蛋白包含1个C4锌指结构,1个配体结合结构域,并且有1个明显的跨膜螺旋。EcE75基因在进化上具有一定的保守性,与甲壳动物聚为一支,与三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、黑背地蟹(Gecarcinus lateralis)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)等亲缘关系最近。EcE75基因在脊尾白虾的各组织中均有表达,其中,眼柄中的表达量最高,卵巢次之。在不同蜕皮分期中,EcRXR与EcECR、EcE75的表达规律基本一致,生殖蜕皮前期和后期表达量都比生长蜕皮高。生长蜕皮和生殖蜕皮因为卵巢发育而存在明显不同,蜕皮激素对卵巢发育的刺激作用,通过EcECR、EcRXR和EcE75基因的表达上调可以体现出来。对EcECR、EcRXR和EcE75基因在不同蜕皮分期的表达研究,为了解虾蟹类蜕皮机制提供了参考信息。     

长期碳酸盐碱度胁迫对脊尾白虾生长及卵巢发育的影响

为探讨碳酸盐碱度对脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）生长及卵巢发育的影响。本研究设置3 mmol/L（对照组）、5 mmol/L和8 mmol/L 3种碳酸盐碱度梯度养殖脊尾白虾60天,比较不同碳酸盐碱度胁迫对脊尾白虾生长性能、组织结构、酶活性以及卵巢发育的影响,结果显示：5 mmol/L组与对照组体长增长率、体重增长率以及成活率差异不显著（P>0.05）,8 mmol/L组体长增长率、体重增长率以及成活率显著低于对照组（P<0.05）。肝胰腺组织切片显示,5 mmol/L组中部分B细胞体积增大,部分转运泡内出现颗粒物质,8 mmol/L组管腔的形态结构严重变形。鳃组织切片显示,5 mmol/L组出现轻微鳃丝肿大现象,角质层略有变形,且角质层下间隙扩张变长,上皮细胞与支柱细胞排列紊乱;8 mmol/L组鳃丝肿大,排列不规则,出现血细胞肿胀现象,鳃丝上皮细胞严重破坏,毛细血管网结构形态改变,角质层下间隙变形。肌肉组织酶活性测定结果显示,5mmol/L组的碳酸酐酶活性显著高于对照组（P<0.05）,Na+/K+-ATP酶活性在肌肉中差异不显著（P>0.05）;肝胰腺组织酶活性测定结果显示,碳酸酐酶在肝胰腺组织中差异不显著（P>0.05）,8 mmol/L组Na+/K+-ATP酶活性显著低于其他组（P<0.05）,鳃组织中,5 mmol/L和8 mmol/L组鳃组织中和Na+/K+-ATP酶活性均显著高于对照组（P<0.05）,且两组间差异显著。卵巢发育统计结果显示,三组脊尾白虾卵巢均能发育,其发育至Ⅱ期的百分比分别为20.51%、10.52%和6.25%,其中5 mmol/L组与对照组间无显著差异（P>0.05）,8 mmol/L组显著低于对照组（P<0.05）;3 mmol/L组和5 mmol/L组均有卵巢发育至Ⅲ期的脊尾白虾,但两组差异不显著（P>0.05）,8 mmol/L组未见有卵巢发育至Ⅲ期的脊尾白虾。卵巢组织切片显示,8 mmol/L组卵原细胞细胞排列疏松,周围滤泡细胞排列疏松且数量较少。综上所述,脊尾白虾可以在低于8 mmol/L的碳酸盐碱度中生长发育,但高碳酸盐碱度可能会造成脊尾白虾鳃和肝胰腺组织损伤,导致其生长受到影响,同时猜测高碳酸盐碱度可能也会影响卵巢的发育速度。     

中国明对虾天门冬氨酸转氨酶基因的克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响

利用RACE技术克隆获得中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)天门冬氨酸转氨酶GOT基因(FcGOT)。FcGOT 基因cDNA全长为1 910 bp, 其中, 开放阅读框1 284 bp, 编码427个氨基酸。同源性分析表明, 中国明对虾天门冬氨酸转氨酶GOT氨基酸序列与其他节肢动物高度保守, 与克氏原螯虾(Procambarus clarkii) 和桔粉蚧壳虫 (Planococcus citri) 的同源性分别为78%和73%。系统进化分析表明, FcGOT基因氨基酸序列与克氏原螯虾GOT聚为一支。组织表达分析发现FcGOT基因在肝胰腺、鳃、血细胞、肌肉、心脏、淋巴中均有表达, 其中肝胰腺中表达量最高。氨氮胁迫后, 荧光定量PCR分析结果表明, FcGOT基因在肝胰腺和鳃组织中的表达与对照组相比具有显著差异(P<0.05), 表明FcGOT基因在氨氮代谢方面具有重要的作用, 参与了中国明对虾机体的急性氨氮胁迫应答反应。

     

盐碱水环境对脊尾白虾基因组DNA甲基化的影响

为探讨盐碱水环境对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)基因组DNA甲基化的影响,本研究利用MethylRAD-Seq技术探究了长期盐碱水养殖组(SAS)和正常海水养殖对照组(SW)脊尾白虾鳃组织中的DNA甲基化水平,并对关键通路和基因进行了差异表达分析。结果显示,脊尾白虾鳃组织基因组中CG和CWG位点(W=A或T)分别检测到2 347 003和416 176处甲基化,甲基化普遍存在于基因组的基因间区和内含子区域,共筛选到8805个(8189个CG-DMSs和616个CWG-DMSs)差异甲基化位点,盐碱水环境下DNA甲基化水平略有增强。通过KEGG富集分析发现,DMS所在差异表达基因显著富集在HIF-1信号通路和剪接体通路,通路中hif-p、hk和sf3b1等关键基因在脊尾白虾盐碱水环境适应中可能发挥着重要作用;对SW和SAS组差异甲基化基因(DMG)进行筛选,得到158个CG-DMGs和94个CWG-DMGs,其中,富集到脂质代谢和囊泡介导的转运通路中的DMG最多;此外,有一些DNA甲基化位点与基因表达呈负相关,表明DNA甲基化与基因调控之间存在复杂的联系,大部分基因组DNA甲基化对基因表达有正调控效应。本研究结果首次分析了在盐碱水环境下脊尾白虾鳃组织的DNA甲基化水平特征,为解析甲壳类盐碱水环境适应机制提供了基础信息。     

塔玛亚历山大藻对中国明对虾鳃组织的氧化胁迫和对Caspase基因(FcCasp)表达的影响

选择在中国分离得到的一株能产生麻痹性贝毒(Paralytic Shellfish Poison, PSP)的赤潮甲藻塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense) ATHK株, 研究其对中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)鳃组织氧化胁迫和Caspase基因(FcCasp)表达的影响。将中国明对虾分别暴露于200 cells/mL 和1 000 cells/mL塔玛亚历山大藻中, 于胁迫后3、6、12、24、48、72和96 h测定鳃的超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性、丙二醛(MDA)含量和FcCasp基因相对表达量, 以不加藻的过滤海水作为对照。结果表明, 在200 cells/mL塔玛亚历山大藻胁迫下, SOD活性、GST活性、MDA含量和FcCasp相对表达量均随取样时间推移表现出先上升后下降的趋势。而在1 000 cells/mL塔玛亚历山大藻胁迫下, SOD活性随时间增加呈现先升高后降低的趋势, 在24~96 h 被显著抑制(P<0.05), GST活性除3和48 h外均被显著抑制(P<0.05), MDA含量和FcCasp相对表达量均整体表现上升的趋势, 呈现出一定的时间效应。相关性分析显示, 塔玛亚历山大藻胁迫下, 中国明对虾鳃的MDA含量和FcCasp相对表达量呈正相关(P<0.05)。实验结果表明, 塔玛亚历山大藻可破坏中国明对虾氧化−抗氧化系统的平衡, 引发对虾鳃组织的脂质过氧化(LPO), 造成其氧化损伤, 从而导致FcCasp表达的上调。本实验结果为将SOD活性、GST活性和MDA含量作为生物标志物, 用于评价塔玛亚历山大藻胁迫提供了依据, 同时也为研究塔玛亚历山大藻对中国明对虾的危害机制提供了参考。

     

脊尾白虾水通道蛋白基因4和11在碱度胁迫过程中的作用

水通道蛋白(aquaporin)是一种细胞膜上特异性转运水分子及其他中性代谢分子的膜蛋白家族,对生物的细胞内外渗透压稳定具有重要的调节作用。为了了解水通道蛋白在脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)应对碱度胁迫中的作用,本研究利用RACE技术成功克隆了脊尾白虾水通道蛋白4 (aquaporin 4, EcAQP4)与水通道蛋白11 (aquaporin 11, EcAQP11)基因cDNA全长,EcAQP4基因的开放阅读框为621 bp,编码206个氨基酸,预测分子量为21.673 kDa,理论等电点为8.30,为疏水性蛋白,具有5个跨膜结构域;EcAQP11基因的开放阅读框长度为783 bp,编码260个氨基酸,预测蛋白分子量为28.490 kDa,理论等电点为5.40,为疏水性蛋白,具有4个跨膜结构域。序列比对结果显示,EcAQP4基因与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)同源性最高,为94.63%;EcAQP11与斑节对虾(Penaeus monodon)同源性最高,为81.47%。为验证水通道蛋白的功能,利用RNA干扰技术特异性沉默EcAQP4和EcAQP11基因,结果显示,碳酸盐碱度胁迫后,注射干扰后的脊尾白虾死亡率显著升高,EcAQP4干扰组72 h死亡率达到45%,EcAQP11干扰组72 h死亡率达到55%,与对照组差异显著(P<0.05)。同时发现,EcAQP4干扰组在碳酸盐碱度胁迫24、48与72 h时的血液渗透压变化幅度显著高于对照组(P<0.05),72 h时渗透压显著升高(P<0.05);EcAQP11干扰组血液渗透压在3个时间点均显著升高(P<0.05)。以上结果表明,水通道蛋白在脊尾白虾应对碱度胁迫过程中起到了调节渗透压、维持体内外离子平衡的作用。     

中国明对虾NHE3基因克隆及其在pH胁迫下的表达

为研究钠/氢交换体(Na+/H+-exchanger,NHE)在中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)响应pH胁迫过程中发挥的作用,首先采用静水毒性实验方法确定了中国明对虾酸碱半致死pH,然后利用RACE技术克隆了中国明对虾Na+/H+-exchanger isoform 3(命名为FcNHE3)基因,并通过荧光定量PCR及RNA干扰技术分析了其在pH胁迫下的表达特征及功能。结果显示,72 h酸性半致死pH和碱性半致死pH分别为5.2和9.1。克隆获得FcNHE3基因(Gen Bank:MF373587)cDNA序列全长3508 bp,开放阅读框2805 bp,编码934个氨基酸,具有信号肽和12个跨膜结构域;蛋白同源分析发现,FcNHE3与青蟹(Carcinus maenas)同源性最高,达到74%;系统进化分析显示,FcNHE3与三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)和青蟹亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明,FcNHE3基因在鳃组织中表达量显著高于其他组织(P0.05);酸性半致死pH(pH 5.2)胁迫下,FcNHE3基因在整个胁迫过程中显著上调表达(P0.05);碱性半致死pH(pH 9.1)胁迫下,FcNHE3基因在前48 h显著下调表达(P0.05),12 h表达量最低,仅在72 h出现上调表达。RNA干扰后,FcNHE3基因表达受到抑制,pH 5.2胁迫下对虾存活率相比对照组显著下降。研究表明相较于高pH胁迫,FcNHE3基因在中国明对虾响应低pH胁迫过程中可能发挥更重要的调节作用。     

磺胺二甲嘧啶对中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)非特异性免疫酶活性的影响

以50、100和150 mg/kg 磺胺二甲嘧啶连续投喂中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)5 d,于给药期间第1、2、3、4、5天及停止投喂药物的第1、2、3、4、5、7、10天取样,测定中国明对虾免疫相关指标超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)和酚氧化酶(PO)活性的变化情况。结果显示,磺胺二甲嘧啶不同给药剂量对酶活性的作用效果不同,投喂渔药期间(0–5 d),低浓度组 SOD 和 PO 活性均极显著高于对照组(P<0.01);AKP 活性于投药第2、3天极显著低于对照组(P<0.01),随后逐渐升高,于第5天显著高于对照组(P<0.05);LZM 活性于投药第3、4天显著低于对照组(P<0.05),于第5天极显著低于对照组(P<0.01)。中浓度组 SOD 活性在前2 d 显著高于对照组(P<0.05),投药3、4 d 显著低于对照组(P<0.05);AKP 活性于第5天活性最高,为对照组的1.14倍;LZM 活性在3、4、5 d 显著低于对照组(P<0.05);PO 活性在投喂药物前期1–3 d 呈上升趋势,极显著高于对照组(P<0.01),于第3天达到最高值。高浓度组 SOD 和 LZM 活性在投药期间显著低于对照组(P<0.05);AKP 活性于投药期间显著高于对照组(P<0.05);PO 活性于1、2 d 极显著高于对照组(P<0.01),随后逐渐下降。停止投喂药物阶段(6–15 d),3个浓度组各免疫相关指标均恢复至对照组水平。研究表明,低浓度磺胺二甲嘧啶对中国明对虾的免疫机能具有一定的影响,高浓度磺胺二甲嘧啶对中国明对虾的免疫机能具有明显的抑制作用。在使用抗菌药物进行抑菌或杀菌的同时,要综合考虑所选择给药剂量对对虾生理机能的影响。     

恩诺沙星对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) CYP2基因表达及氨基比林-N-脱甲基酶活性的影响

以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象,运用RT-PCR方法测定CYP2基因在凡纳滨对虾组织中的表达分布,并分析不同剂量恩诺沙星对凡纳滨对虾肝胰腺中CYP2基因表达和氨基比林-N-脱甲基酶(APND)活性的影响.结果显示,CYP2在肝胰腺、鳃、血淋巴、肌肉、甲壳、肠、胃、心脏和眼柄中均有分布,在肝胰腺中表达量最高,胃次之,血淋巴中表达量最低.口服低(15 mg/kg)、中(30 mg/kg)、高(60 mg/kg)3个剂量恩诺沙星药饵后,凡纳滨对虾肝胰腺中CYP2基因表达和APND活性较对照组均呈现下降趋势;药物浓度越高,基因表达量和酶活性越低,表明恩诺沙星可抑制CYP2在凡纳滨对虾体内的表达.在生产实践中联合用药时,应考虑到因恩诺沙星对CYP2的抑制作用而导致经其代谢的药物在生物体内的蓄积和毒性增强.