应用酵母双杂交技术筛选猪Calsarcin-2蛋白结合蛋白

Calsarcins是钙调磷酸酶肌小节特异性结合蛋白家族,本实验旨在研究Calsarcin-2(CS2)在猪骨骼肌纤维形成和信号通路调控中的功能。应用酵母双杂交方法筛选猪骨骼肌组织中CS2蛋白结合蛋白,从猪骨骼肌文库中筛选出180个阳性克隆,经分析得到12个相互作用的蛋白,研究发现骨骼肌α-肌动蛋白1(ACTA1),肌联蛋白(TTN)及钙调素1(CALM1)为CS2互作蛋白。ACTA1参与肌肉收缩过程,TTN调节肌小节动力传导及Z线装配,CALM1参与钙离子信号传导。结果表明,CS2在维持Z线结构稳定和参与钙离子信号传导方面起重要作用。     

利用酵母双杂交系统筛选猪Calsarcin-1基因相互作用蛋白

 【目的】利用酵母双杂交系统研究与猪Calsarcin-1相互作用的蛋白,了解Calsarcin-1在猪骨骼肌纤维类型形成和信号通路的调控功能。【方法】首先用长白猪Calsarcin-1基因构建既无自激活性又无毒性的pGBKT7-CS1诱饵载体;然后从猪的骨骼肌组织样中提取mRNA，利用SMART技术合成并纯化双链cDNA;最后通过酵母双杂交系统的共转化法筛选与Calsarcin-1相互作用的蛋白，在GenBank中比对分析相互作用基因，分析Calsarcin-1在骨骼肌中的功能。【结果】构建了pGBKT7-CS1诱饵载体，获得具有完整3′端的猪骨骼肌单链cDNA，并合成双链cDNA。筛选出4个与Calsarcin-1相互作用的蛋白，经与人的基因比较分析，发现Calsarcin-1与α-1肌动蛋白和α-3辅肌动蛋白互作，与骨骼肌Z线附近结构形成有关;与肌集钙蛋白-1和肌钙蛋白T3互作，影响钙离子的调控。【结论】分析所筛选出的蛋白功能，推测Calsarcin-1通过结合这些蛋白，维持细胞结构的稳定，影响相关蛋白的钙离子结合能力，从而参与钙离子调控;而钙离子浓度的变化将影响到其它控制肌纤维分化的因子，或其它调控通路，共同调节快慢肌纤维的形成与转化。