小熊猫耳部成纤维细胞的培养和冷冻保存

小熊猫(Ailurus fulgens)是生活在陆地上的活化石,在类熊类哺乳动物的进化史中具有关键的作用,但近年来数量急剧下降,因此小熊猫的品种保护逐渐受到人们的重视.细胞的培养和冷冻保存已经成为种质资源保护的重要方法.本试验采取小熊猫的耳部组织,用组织培养法对小熊猫组织进行原代、继代培养并成功进行了冷冻和解冻处理,建立了耳部成纤维细胞系.并对培养的细胞进行了形态学观察,该细胞系的建立填补了小熊猫体细胞培养的空白,使得小熊猫种质资源在细胞水平上得到了保存.     

表皮生长因子、成熟时间和牛卵泡液对山羊卵母细胞体外成熟的影响

卵母细胞的体外成熟受多种因素的影响,成熟效率仍有待提高。本实验研究了表皮生长因子(EGF)、成熟时间和牛卵泡液(bFF)对山羊卵母细胞核成熟的影响。培养液中添加10-30 ng/m l的EGF对山羊卵母细胞第一极体(PB1)排出率无显著影响;体外成熟17h时第一极体排出率与成熟19h无显著差异,而明显低于其他组(P<0.05),在成熟19-25h间第一极体排出率没有显著变化;10?F在胎牛血清(FBS)有无的条件下对山羊卵母细胞第一极体排出率均无显著影响。结果表明:不同的成熟时间对极体的排除率有一定的影响;而添加一定剂量的EGF、bFF对黄淮山羊卵母细胞的核成熟无明显影响。     

黄淮白山羊孤雌胚胎的体外培养

采用离子霉素和6-DMAP对黄淮白山羊体外成熟卵母细胞进行联合激活,分别在不同的培养体系进行体外培养,观察孤雌胚胎的发育情况。培养体系分别为:无共培养条件下,M199(10?S)、CR1aa和HTF P1;颗粒细胞共培养条件下,CR1aa、HTF P1和SOFaa。结果发现,无共培养条件下,CR1aa和HTF P1组孤雌胚胎的卵裂率显著高于M199组(P<0.05),但3组均未有囊胚;共培养条件下,HTF P1组的卵裂率显著高于CR1aa和SOFaa组(P<0.05),而CR1aa组的囊胚率却显著高于其他2组(P<0.05)。综合试验结果说明,CR1aa联合颗粒细胞共培养能够获得较好的培养效果,适用于山羊孤雌胚胎的体外培养。     

黑麂耳成纤维细胞培养及异种重构胚构建

黑麂(Muntiacus crinifrons)是我国特有的珍稀濒危物种。采用组织块贴壁法获得了纯化的黑麂耳成纤维细胞。用3种不同的培养液(DMEM(低糖)、DMEM(高糖)和RPMI-1640)对第3代细胞进行培养,结果细胞群体倍增时间相近,DMEM(低糖)的培养效果稍好。以黑麂耳成纤维细胞为核供体,以山羊和兔卵母细胞为胞质受体,通过核移植构建异种克隆胚,囊胚率分别为0和11.5%,结果表明两种胞质受体均能支持黑麂耳成纤维细胞核的重编程,但重构胚的发育能力有所差别。     

波尔-黄淮白山羊体细胞核移植重构胚电融合参数的选择

以波尔山羊耳成纤维细胞为核供体细胞,黄淮白山羊卵母细胞为受体进行核移植,对重构卵进行电融合处理,发现电融合参数为250 V·mm-1、1次电脉冲时,40μs组的卵裂率显著高于10 μs组和20μs组(P＜0.05),但10μs组融合后的存活率最高(P＜0.05).当融合参数为250 V·mm-1、10μs时,2次电脉冲组的卵裂率显著高于1次电脉冲组(P＜0.05),但1次电脉冲组的融合后存活率和胚胎获得率均高于2次脉冲组(P＜0.05).综合试验结果认为,适宜的山羊体细胞核移植的电融合参数是250 V·mm-1、10μs、1次电脉冲.