Q热贝纳柯克斯体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据Q热贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)插入IS1111序列设计引物和探针,建立快速检测Q热的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,该方法能够检测出10个拷贝数的阳性质粒;标准曲线相关系数为0.995,扩增效率为103%;结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、衣原体(C.psittaci)、布鲁氏菌(Brucella.spp)及牛血液的核酸样本特异性检测结果均为阴性。本研究建立的TaqMan荧光定量PCR法灵敏度高、特异性好,对Q热的检测与鉴定中具有良好的应用前景。     

融合蛋白Rv3872/CFP-10/ESAT-6的制备及在牛结核诊断中的初步应用

本研究通过融合表达Rv3872、CFP-10和ESAT-6蛋白,以改良牛结核病特异性鉴别诊断抗原CFP-10-ESAT-6,提高牛结核抗体鉴别诊断法的灵敏度。利用PCR方法,克隆牛分枝杆菌RD1区上述三个基因,通过酶切连接方法,将三个基因串联在pET-28a载体上,基因之间用Linker序列连接。融合基因在大肠杆菌内经IPTG0.4mmol/L诱导3h,目的蛋白经SDS-PAGE证实表达在上清中,Western-blot分析证实表达蛋白具有免疫原性。以所表达的融合蛋白作为包被抗原建立间接ELISA,检测了44份牛分枝杆菌感染背景清楚的临床奶牛血清。26份阳性血清中,Rv3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白ELISA检出阳性样本18份,检测灵敏度为69%,而CFP-10-ESAT-6融合蛋白ELISA只检出阳性样本4份。18份阴性血清中,两种ELISA均检出17份阴性血清,特异性都为94%（17/18）。因此,Rv3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白在对牛结核抗体检测特异性没有降低的情况下,敏感性获得了显著提高,这对牛结核病的早期鉴别诊断方法的建立具有重要意义。     

荧光定量检测评估规模化猪场环境中PEDV病毒载量

试验选择某腹泻暴发场(母猪规模13 000头),通过检测门卫室、转猪车轮胎、水源、产床、鞋底等区域棉拭子中PEDV载量,查找到猪场生物安全上容易存在的漏洞(产房消毒不彻底、鞋底携带病毒、转猪车轮胎消毒不彻底、工作人员窜场导致感染范围扩大、工作人员清洗体表不彻底等),通过荧光定量全面评估猪场环境中PEDV载量,查找生物安全漏洞,建立健全的生物安全体系的评估机制。结果表明,经过1个月的整改,最终该猪场环境中PEDV载量急剧下降,阳性率由整改前的100%(8/8)降低为整改后的21.43%(3/14),从而帮助该猪场降低环境PEDV载毒量,并建立完善的PEDV防控的生物安全体系。     

肉牛传染性牛支原体肺炎流行的初步诊断

自2008年以来,湖北省多个地区肉牛养殖场(户)发生以肺肉变及坏死为特征的呼吸道传染病,病牛咳嗽,消瘦,有的继发关节炎.常规抗生素治疗效果差,犊牛及体弱牛病死率高.为此,本研究组采集病牛样本(血液和肺等内脏器官),对该病开展了流行病学与病原学研究.实验室检测项目包括:1)支原体培养鉴定,PCR扩增与基因测序鉴定;2)细菌分离鉴定;3)牛结核诊断,包括牛结核菌素皮内变态反应、牛结核菌抗酸染色、牛结核菌培养鉴定,与牛血清结核抗体ELISA检测;4)泰勒虫血涂片检测与PCR检测等.     

Q热贝氏柯克斯体间接ELISA检测方法的建立

本研究以Q热贝氏柯克斯体弱毒株Ⅱ相全菌为包被抗原建立Q热贝氏柯克斯体间接ELISA检测方法,通过方阵滴定法对抗原包被浓度和二抗反应浓度的确定及各项反应条件的优化,确定其阴阳性临界值为0.44。用本方法与IDEXX Q热抗体检测试剂盒对393份牛临床血清进行检测,检出的血清阳性率分别为11.45%和6.10%,符合率为94.66%。结果表明,本试验建立的检测Q热贝氏柯克斯体的间接ELISA法具有较好的特异性及较强的敏感性,可初步应用于Q热贝氏柯克斯体抗体的临床检测。     

梅花鹿γ干扰素克隆表达及抗病毒活性测定

提取经植物血凝素诱导培养的梅花鹿外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出梅花鹿γ干扰素成熟蛋白基因并将其克隆到pMD18-T载体上,测序结果表明,扩增片段为梅花鹿γ干扰素成熟蛋白序列,与GenBank上发表的干扰素序列同源性为100%.将其重组到原核表达载体pET32a(+)上,并在大肠埃希菌BL21中实现了高效表达.表达产物以His-Tag融合蛋白的形式存在,表达量约占细菌总蛋白的32.6%.用镍亲和层析法对蛋白进行纯化,并利用VSV-MDBK/IBRV细胞系统分析其生物活性,重组梅花鹿γ干扰素抗病毒活性分别约为7.25×104 U/mL和4.61×104 U/mL.结果表明,重组梅花鹿γ干扰素特异性好,而且抗病毒活性比较稳定.     

肉牛传染性牛支原体肺炎流行的诊断

采用多种诊断方法,对2008年以来湖北省多个地区新引进育肥肉牛呼吸道传染病进行了病原学研究.患牛病理变化主要集中在肺部,轻者可见肺局部肉样变,严重者可见肺广泛分布干酪样或化脓性坏死灶.将肺坏死组织制作石蜡切片,显微镜观察发现,肺组织表现为坏死性肺炎,未见典型的结核结节.实验室病原检测项目包括:支原体培养鉴定,PCR检测与目的基因测序鉴定;细菌分离鉴定;牛结核检测;泰勒虫血涂片检测与PCR检测等.最终确定该新发呼吸道传染病为牛支原体(Mycoplasma bovis)肺炎.同时,环形泰勒虫混合感染与细菌继发感染率很高,使病情复杂化.通过药敏试验发现,不同牛场分离的牛支原体最敏感药物为环丙沙星,其次为左氟沙星、四环素.文中还对该病的综合防治提供了合理的建议.     

奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法的建立及应用

奶牛白细胞黏附缺陷症（bovine leukocyte adhesion deficiency,BLAD）是一种常染色体隐性、致死性、遗传性疾病,严重影响奶牛生产性能和奶牛场的经济效益。为建立快速可靠的BLAD检测方法,本试验根据GenBank中BLAD CD18序列设计引物,PCR扩增后纯化产物,构建A/A、A/G和G/G 3种基因型标准质粒。用标准质粒建立焦磷酸测序检测方法。用建立的方法检测奶牛血液样品,其结果与Sanger测序结果进行比较,分析和验证检测结果的准确性。用建立的方法对300份奶牛血液样品进行检测,结果显示样品中A/A基因型检出294例,占总体比例的98%;A/G基因型检出6例,占总体比例的2%。随机抽取30份已检测样品进行Sanger测序,结果显示与焦磷酸测序法结果一致。本试验结果表明焦磷酸测序法检测BLAD,具有特异、灵敏、快速的特点,其检测结果准确可靠,适合于试剂盒的研发及应用于BLAD的临床诊断。     

小鼠髓源未成熟树突状细胞的分离与培养

本试验旨在建立一种体外诱导培养小鼠未成熟树突状细胞(dendritic cell,DC)的方法。应用重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rGM-CSF)在体外诱导小鼠骨髓前体细胞分化为未成熟树突状细胞,进行形态学观察、细胞表型分析、刺激T细胞增殖等方法,对小鼠髓源未成熟树突状细胞的体外诱导培养进行鉴定。试验结果显示,小鼠骨髓来源的DC在体外培养8 d后,特异性细胞表面标志CD11c的表达量达到81.09%,中度表达MHCⅡ,低表达CD40、CD80、CD86。本试验成功地建立了体外小鼠髓源DC扩增的方法。