江苏省水稻品种对稻曲病的抗病性鉴定及病菌致病力分化

用人工注射接种的方法鉴定了江苏省主要水稻品种对稻曲病的抗病性,研究了稻曲病菌的致病力分化.结果表明:在198个品种中,盐稻1201、南京17113等44个品种对稻曲病表现为完全免疫(CI);淮66、常优008、淮68等34个品种表现为高抗(HR);寸三粒、香优953等29个品种表现为抗病(R);A2、芒小白万等37个品种表现为中抗(MR);香子糯、早插稻等31个品种为中感(MS);天丰优559、盐优1120等15个品种表现为感病(S);黄壳油占、小红粳、CVR4等8个品种表现为高感(HS).用46个单孢菌株分别对粤938、淮9508、武运粳3号3个已知不同抗性品种进行致病力分化的研究,结果表明不同抗病性的品种对同一菌株的反应差异较大,不同菌株对同一品种的致病力有显著差异,致病力分化较明显.  

枯草芽孢杆菌Bs916中脂肽抗生素Bacillomycin L的操纵子结构及生物活性

 【目的】明确枯草芽孢杆菌Bs916(Bacillus subtilis 916)分泌的脂肽化合物Bacillomycin L操纵子、结构和生物活性,阐明枯草芽孢杆菌Bs916防治病害的分子生化机制。【方法】采用LA-PCR和基因步行的方法克隆bacillomycin L的操纵子Bac;通过生物信息学的方法分析Bac操纵子的遗传特征;运用基质辅助解离质谱法测定Bac操纵子合成的脂肽类化合物bacillomycin L的分子量;利用碰撞诱导解离(CID)技术获得化合物的典型结构特征离子碎片测定bacillomycin L肽端的一级结构;通过平板对峙实验和溶血活性试验测定bacillomycin L的生物活性。【结果】克隆到全长约39.0 kb的Bac操纵子,该操纵子由Bac D、Bac A、Bac B和Bac C 4个多功能复合酶及1个启动子组成;生物信息学分析表明Bac操纵子与脂肽类化合物iturin A、 mycosubtilin、 bacillomycin D操纵子具有很高的同源性,然而也发现一段低同源性区域,该区域是一个新型Ser激活结构域。根据Bac操纵子特征推测Bac操纵子编码的脂肽类化合物可能是Bacillomycin L;Bac合成的脂肽类化合物的分子量分别为：1 008,1 022,1 036和1 050 Da;推测属于相差一个(-CH2)亚甲基的同系物;脂肽化合物的一级结构为[cyclo-(Asn-Tyr-Asn-Ser-Glu-Ser-Thr-β-amino fatty acid)],该一级结构与以前报道的bacillomycin L的肽序列一致。生物活性测定结果表明其是一种生物表面活性剂,具有广谱抗真菌活性。【结论】本研究克隆了bacillomycin L的完整操纵子,并通过对操纵子生物信息学分析和生化试验鉴定了枯草芽胞杆菌Bs916分泌的脂肽bacillomycin L的化学结构,并阐明了生防菌Bs-916分泌的脂肽bacillomycin L是其抗真菌活性的关键因子。  

水稻稻瘟病菌拮抗细菌的筛选与鉴定

采用平板测定法和盆栽试验结合筛选对稻瘟病菌具有高效抑菌活性的拮抗细菌，结果表明：从江苏省南京市、丰县、泗阳县等地的50份稻田水稻根际土壤样品中，得到1 015个细菌分离物，共获得45株对稻瘟病菌具有高效抑菌活性的拮抗细菌，其中10株对稻瘟病菌、水稻纹枯病菌和水稻稻曲病菌、水稻细菌性条斑病菌及水稻白叶枯病菌均表现出较强的广谱抗菌活性(对5种水稻病原菌平均抑制率在45％以上)。水稻苗瘟的盆栽防治效果表明：拮抗细菌T429和T392具有较好的防治效果，分别达到69.4％和61.1％。结合理化特性和16S rDNA鉴定，T429为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，T392隶属伯克霍尔德菌属(Burkholderia)。  

水稻稻瘟病接种技术及2009年江苏省区试品种抗性鉴定

本试验分别进行了水稻稻瘟病苗瘟接种和穗颈瘟接种技术研究,并对江苏省2009年水稻区试品种的稻瘟病抗性进行了鉴定.结果表明:不同类型水稻品种对苗瘟和穗颈瘟抗性不同,其中杂交籼稻、杂交粳稻抗性较好;常规粳稻和迟播稻的抗性较差;单个水稻品种对苗瘟的抗性和穗颈瘟的抗性不完全一致.  

稻曲病菌突变体B-726生物学性状分析及其T-DNA插入位点侧翼序列的克隆

【目的】分析稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B-726的生物学性状，分析其T-DNA插入位点的侧翼序列，克隆因外源基因插入被破坏正常表达的基因，为明确该基因在稻曲病菌致病过程中的作用奠定基础，并为稻曲病防治新途径的制定提供理论依据。【方法】通过测定突变菌株B-726生长速率、产孢能力及致病力检测，分析其生物学性状；Southern杂交分析B-726外源基因插入的拷贝数；利用HiTail-PCR 获得T-DNA插入位点的侧翼序列；运用RACE-PCR技术，克隆与插入位点毗邻的基因全长；用半定量RT-PCR分析该基因表达情况。【结果】突变菌株B-726与野生菌株P1相比致病力极显著下降，产孢能力、生长速率显著下降。Southern杂交结果显示T-DNA在菌株B-726中以单拷贝形式插入。经过序列分析发现，T-DNA插入在1个命名为Uvt-726上游344 bp处，半定量PCR结果表明，Uvt-726在B-726表达量较P1显著下降。【结论】克隆了1个可能与稻曲病菌致病力相关的基因，推断该基因在稻曲病菌致病过程中起着重要的作用。  

枯草芽胞杆菌Bs-916的全基因组分析

 【目的】对枯草芽胞杆菌Bs-916进行全基因组测序，为今后更好挖掘和利用该菌生防潜力提供较多的分子生物学信息。【方法】通过应用比较基因组学软件与另一测序菌株Bs168进行全基因组序列分析。【结果】Bs-916菌株全基因组大小为3 925 958 bp，GC含量为46.4%，与其它已测序全基因组芽孢杆菌相比，其GC含量最高；预测所得CDS数为4 056个，152个串联重复区域，转座子103个，IS（插入序列）序列数量37个， tRNA 46个，rRNA 39个；比较基因组学分析其含有8个NRPS/PKS基因簇，其中bacillomycin L，macrolactin，difficidin这3个基因簇在比较菌株Bs168中不存在；该菌还含有植酸酶基因、comAPQX及sfp等与生防因子相关的基因。【结论】Bs-916菌株全基因组含有多种抗菌物质编码基因簇，是一类具有极大生防潜力的典型根际革兰氏阳性菌株。该菌株全基因组序列的测定及其遗传操作方法的可行性，有利于其次生代谢产物的开发和利用。次生代谢产物具有潜在的应用价值，有望在未来开发成独特的农业生物工程制剂。  

2001～2010年江苏省稻瘟病菌种群变化分析

2001～2010年从江苏省五大水稻栽培区采集了1 269份水稻稻瘟病菌标样,分离获得818株单孢菌株,利用7个全国统一鉴别水稻品种进行鉴定,共获得7群40个生理小种.结果显示,ZG1群小种出现频率最高,达到58.3%,为优势小种;其次为ZB群小种,达到16.9%.江苏省稻瘟病菌种群在五大稻区分布不同,在徐州、盐城地区,稻瘟病菌小种类群较为简单,均出现了7群18个小种;在南京、苏州和南通地区,稻瘟病菌小种组成较为复杂,分别出现了7群22个小种、7群23个小种和7群21个小种,尤其在苏州地区,仅ZB群小种的类型就多达11个.2001～2010年优势小种ZG1始终保持高频率出现,2006年最高,达到了73%;2009年最低,为41.4%.ZB群小种在2009年出现频率达到了最高,为31.4%.2001～2010年稻瘟病菌种群监测结果说明,江苏省稻瘟病菌和主栽品种之间具有较高的亲和性.  

4株拮抗细菌与链霉素、叶枯唑协同控制水稻细菌性条斑病研究

研究了4株拮抗细菌对细菌性条斑病菌的抑制活性和6种化学药剂对细菌性条斑病菌的毒力,探讨了它们协同控制水稻细菌性条斑病的效果.结果表明,叶枯唑和链霉素对水稻细菌性条斑病菌具有较强的抑制作用,杀真菌剂苯醚甲环唑、丙环唑对水稻细菌性条斑病具有较好的杀菌活性;4株拮抗细菌对细菌性条斑病菌均有较强的抑制能力,其中X-35对细菌性条斑病菌的抑制效果最为明显,抑菌圈面积为804.3 mm2,B-916、X-1、X-10的抑菌圈面积分别为675.6、522.0、755.9 mm2.上述4株拮抗细菌与链霉素、叶枯唑具有较好的相容性,在500 μg/mL链霉素、500 μg/mL叶枯唑时,4株拮抗细菌均可正常生长;4株拮抗细菌分别与链霉素、叶枯唑混配后,对水稻细菌性条斑病具有较好的防治效果,其中拮抗细菌B-916、X-10与链霉素混配后,均比单用化学农药的防治效果好,提示拮抗细菌B-916、X-10可以部分替代链霉素、叶枯唑用于防治水稻细菌性条斑病.  

拮抗细菌T429和T392的生物活性及其对水稻白叶枯病的防治效果

为了探索水稻白叶枯病的生物防治技术,本试验研究了枯草芽孢杆菌(T429)和伯克氏菌(T392)的生物学活性及其对水稻白叶枯病的防控效果。结果表明,T429具有分泌蛋白酶、纤维素酶和嗜铁素的能力,T392具有分泌嗜铁素和解磷的能力;同时,2株生物防治菌株均可以促进水稻生长。对水稻白叶枯病的防治效果表明,T429和T392对苗期水稻白叶枯病的防治效果分别为57.14%和68.25%;T429和T392对成株期水稻白叶枯病的防治效果分别为40.29%和45.56%。表明T429和T392对水稻白叶枯病具有较好的防治效果。  

枯草芽孢杆菌Bs-916草酸脱羧酶基因Bacisubin的克隆、原核表达及其表达产物的酶活性分析

为明确枯草芽孢杆菌生防菌株Bs-916的抑菌蛋白质Bacisubin的编码基因,并初步解析Bacisubin的抑菌机理,根据该蛋白质的部分序列设计简并引物,获得了编码基因的部分序列,参考基因组数据库克隆了Bacisubin基因全序列。将Bacisubin基因克隆至PET28a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中表达获得His标签融合蛋白质,并利用次甲基蓝-重铬酸钾法初步检测了该融合蛋白质的酶催化活性。克隆获得Bacisubin基因开放阅读框序列共1 161 bp,G+C含量为51.3%,可编码386个氨基酸,编码蛋白质与Bs-168菌株的草酸脱羧酶Yvrk蛋白质的氨基酸相似度为87%,与其他多种细菌和真菌的草酸脱羧酶的N端和C端Cupin活性中心区域和Mn2+结合区域高度保守。预测Bacisubin分子量为43 600,等电点为5.18,是较稳定的可溶性草酸脱羧酶,其催化最适pH为6.0左右,最适温度为30℃左右。说明枯草芽孢杆菌Bs-916的抑菌蛋白质Bacisubin为草酸脱羧酶,抑菌作用可能与其降解草酸的能力有关。