一种快速鉴定半滑舌鳎遗传性别的方法

半滑舌鳎(Cynoglossus semiliaevis)遗传性别快速准确鉴定的方法是性别控制与高雌苗种培育的基础,其性别决定机制为ZW型,遗传雌鱼为异型染色体ZW,遗传雄鱼为同型染色体ZZ.本研究在半滑舌鳎全基因组测序结果的基础上,通过分析Z染色体和W染色体差异序列,设计一对跨Z/W染色体同源差异DNA片段的引物CS-SEX-F和CS-SEX-R,取半滑舌鳎部分鳍条通过碱煮沸方法获得的DNA为模板,采用PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳方法鉴定半滑舌鳎遗传性别.通过该方法在遗传雄鱼(ZZ)个体中可以扩增出366 bp的DNA条带,遗传雌鱼(ZW)个体中可以扩增出366和253 bp两种DNA条带.本研究建立了一种新的成本低廉、操作快速、结果准确可靠的鉴定半滑舌鳎遗传性别的方法,该方法与已有方法相比,操作简便省时,为半滑舌鳎遗传学研究与性别控制育种相关研究提供了可靠分子标记,在半滑舌鳎遗传性别鉴定和养殖场所内伪雄鱼快速检测方面具有广阔的应用前景.     

半滑舌鳎TLR5S 三种剪切型基因的克隆与表达分析

Toll样受体5(Toll-like receptor 5,TLR5)是TLRs家族成员之一,可分为跨膜型TLR5M和鱼类特有的可溶型TLR5S,它们可以识别致病菌表面的鞭毛蛋白并协同作用激活免疫反应。为了研究半滑舌鳎受到病原感染后TLR5S参与免疫反应的作用,本研究使用RACE技术获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)TLR5S全长c DNA序列。TLR5S c DNA有3种剪切型:Cs.TLR5S x1,Cs.TLR5S x2和Cs.TLR5S x3。这3种剪切型的相同区域为308 bp 5′非编码区(5′UTR)和1701 bp开放阅读框(ORF),不同的3′UTR分别为138 bp、364 bp和637 bp。Cs.TLR5S共编码567个氨基酸,预测编码蛋白质分子量为64.03 k D,等电点为8.49。氨基酸多重序列比对结果显示,Cs.TLR5S氨基酸序列与其他脊椎动物TLR5S氨基酸序列具有较高的相似性,其中与牙鲆相似度高达61%,表明Cs.TLR5S在进化上的具有一定的保守性。Real-time PCR结果表明该基因在半滑舌鳎的不同组织均有表达,其中在肝的表达量最高,在脾的表达量最低。此外,检测Cs.TLR5S 3′端的不同剪切型在肝、脾、头肾、小肠中的表达,结果显示Cs.TLR5S x3只在肝中高表达,而Cs.TLR5S x1则在肝和小肠中都有中等程度表达。鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染半滑舌鳎实验表明,注射菌液6 h后,Cs.TLR5S基因在肾、小肠、肝和脾4个组织中的表达量都有显著上升;注射鳗弧菌48 h后,以上4种组织中表达量均呈现降低的变化。上述实验结果说明,Cs.TLR5S基因可能参与了半滑舌鳎抗弧菌感染的免疫反应。     

ＭＨＣ基因的遗传变异及其与鱼类抗病性研究进展

概述了主要组织相容性复合体(MHC)的结构与功能以及在脊椎动物特别是鱼类中的研究进展。对MHC基因的遗传变异与鱼类抗病性机制做了较为详细的阐述,介绍了MHC的遗传变异与多种鱼类抗病性关系的研究进展,重点介绍了草鱼MHC基因的研究。展望了MHC基因在鱼类及草鱼未来抗病育种中的研究前景。     

尼罗罗非鱼MHC ⅡA基因的克隆、表达及多态性分析

为进一步了解鱼类MHC ⅡA基因的特点及其在免疫反应中的功能,采用同源克隆、RACE-PCR、巢式PCR等技术,从健康的尼罗罗非鱼体获得1 205 bp的MHC ⅡA基因cDNA全序列(Orni-DBA-0101,Genebank登录号:JF719813)及1 388 bp的基因组序列。序列分析发现,尼罗罗非鱼MHC ⅡA基因含4个外显子和3个内含子,开放阅读框长720 bp,编码239个氨基酸。从4尾尼罗罗非鱼中共得到8条不同的cDNA序列,分别编码不同的氨基酸序列。氨基酸序列比对后发现,序列间存在丰富的多态性,且主要集中在α-1区,多态性位点数远远高于半滑舌鳎MHC ⅡA基因。生物信息学分析表明,尼罗罗非鱼MHC ⅡA编码的蛋白质分子包含1个信号肽、2个胞外结构域、1个跨膜区和1个胞质区,存在4个保守的半胱氨酸残基以及丰富的磷酸化位点,与其他物种的相似性为23%～65%。RT-PCR结果表明,MHC ⅡA基因在脾、肾、肠、鳃、性腺、肝、心脏表达量很高,在鳔和肌肉中表达量最低。人工感染嗜水气单胞菌后,肝、脾、肾、鳃、肠5个组织中MHC ⅡA基因的mRNA水平均发生了不同程度的变化,提示MHC ⅡA分子作为一种重要的免疫因子,在清除病原的免疫反应中起着重要作用。     

弓背青鳉早期胚胎色素细胞发生及相关基因表达规律分析

体表色素具有保护鱼类免受紫外线辐照伤害等重要功能。依照自然选择理论,不同群体的体色形成过程可能受到光照等环境因素的选择作用而发生遗传分化。为了检验这一假说,本研究以相同条件下人工繁育的不同纬度的弓背青鳉(Oryzias curvinotus)群体（饶平、高桥、三亚）后代（F6）为材料,使用荧光倒置显微镜对早期胚胎的黑色素细胞和虹彩色素细胞进行观察统计,并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析4种色素细胞发生关键基因（黑色素形成的限速酶基因tyr、虹彩色素细胞相关基因alk、sox10和pax3）在高桥群体后代早期发育（6-10,12,14肌节期）过程中的表达加以验证。结果表明,高纬度饶平群体早期胚胎的黑色素细胞和虹彩色素细胞分别集中出现于8肌节期和10肌节期,占比为81.9%和52.1%;相应地,高桥群体早期胚胎的黑色素细胞和虹彩色素细胞分别集中出现于7和11肌节期,占比47.7%和42.1%;而三亚群体早期胚胎的黑色素细胞和虹彩色素细胞分别集中出现于8和12肌节期,占比 44.0%和62.2%。对高桥F6代胚胎样本的色素细胞发生相关基因qRT-PCR检测确定：tyr表达水平从6肌节期开始上调,至10肌节期趋于平稳;而抑制黑色素形成通路并启动虹彩细胞分化通路的sox10和pax3基因与下游的虹彩色素细胞相关基因alk在10-14肌节期均呈现一致的单峰表达模式。综上,本研究支持弓背青鳉早期发育阶段的黑色素细胞和虹彩色素发生模式与鱼类经典理论相符,受tyr、alk、sox10、pax3等基因的有序表达的调控,且证实了发生阶段存在由遗传因素决定的群体分化,低纬度群体的虹彩细胞发生更晚,其具体机制仍待进一步研究。     

湖栖鳍虾虎鱼皮肤和眼睛转录组比较

为了对湖栖鳍虾虎鱼的皮肤和眼睛进行转录组比较分析,实验通过测序原始数据,经denovo拼接、组装共获得103686个单基因(unigene), N50和平均长度分别为1 456和2 490 bp。在Nr、Nt、KO、SwissProt、PFAM、GO及KOG数据库中对上述unigenes进行注释,分别有57 380、 37 343、 31 700、 51 277、 47 020、 47 555和25 604个unigenes获得注释。对差异基因进行KEGG富集发现,在黑色素生成途径中,tyr、tyrp1和tyrp2等基因在皮肤中明显下调。基因表达差异分析显示,在湖栖鳍虾虎鱼皮肤和眼睛中共有8 113个差异表达基因(DEGs),其中3 174个DEGs在皮肤中上调,4 939个DEGs在眼睛中上调。通过实时荧光定量PCR(qPCR)对10个DEGs的验证,确定了RNA-Seq分析正确。本研究丰富了湖栖鳍虾虎鱼的体色研究,为湖栖鳍虾虎鱼遗传资源的利用提供了数据,也为进一步研究鱼类绚丽的体色形成机制提供了参考。     

半滑舌鳎CD40基因克隆及其免疫功能分析

本研究通过RACE技术在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)中克隆得到1个CD40同源基因。该基因c DNA全长为2098 bp,开放阅读框为1011 bp,可编码由336个氨基酸组成的蛋白质。推导得到的CD40氨基酸序列包含1个信号肽、1个跨膜结构区、2个N-糖基化位点以及含4个富含半胱氨酸的保守结构区。不同物种氨基酸序列同源分析结果显示,该基因与哺乳类、两栖类以及硬骨鱼类相似性为28%~47%,其中与硬骨鱼类相似性较高。系统进化分析结果显示,半滑舌鳎CD40与其他硬骨鱼类CD40聚类为一支,哺乳类与两栖类CD40聚类为另一支。荧光定量PCR结果显示,CD40在健康半滑舌鳎不同组织中均有表达,其中在鳃、肝和脾等组织中表达量较高,在肠、肌肉和皮肤中表达量较低,在脑和肾中微量表达。经哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染刺激后,与PBS处理的对照组相比,该基因m RNA在半滑舌鳎3个主要免疫组织(肝、脾和肾)中表达量均呈显著性升高,在肝中12 h到达峰值,在脾和肾中6 h达到峰值。上述结果表明CD40基因参与了半滑舌鳎抵抗哈维氏弧菌的免疫应答反应。     

尼罗罗非鱼致病性嗜水气单胞菌的分离鉴定与药敏试验

从自然患病的尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)肝脏组织分离出2株细菌,命名为M-O1和M-02。用M-O1和M-02分别在实验室人工感染健康的尼罗罗非鱼,被感染鱼3周内全部死亡,且患病症状与自然发病症状一致。从被感染的鱼体中分离得到2株类似细菌(分别命名为W-01、W-02),说明分离的菌株为本次尼罗罗非鱼出血性败血症的病原菌。通过生理生化方法进行种属鉴定,确认以上分离到的4株细菌均为嗜水气单胞菌(Aeromonaz hydrophila),分别命名为M-O1、M-02、W-01、W-02。用19种常见药物对上述菌株进行药敏试验,4菌株对丁胺卡那、氟哌酸、庆大霉素、链霉素、恩诺沙星、新霉素、氟罗沙星和复方新诺明极为敏感;对氧哌嗪青霉素、利福平、麦迪霉素、红霉素、罗红霉素和阿奇霉素敏感,对羧苄青霉素、头孢噻吩、先锋霉素、氨苄青霉素和林可霉素为不敏感。     

湖栖鳍虾虎鱼性腺转录组比较分析

为获得湖栖鳍虾虎鱼性腺基因表达谱,筛选性别决定、配子发生和繁殖相关基因,实验对其卵巢和精巢分别进行了RNA-Seq分析。测序原始数据经de novo拼接组装共获得62 573个单基因(unigene),N50和平均长度分别为3 082 bp和1 869 bp。在NR、NT、SwissProt、PFAM、KOG、GO及KEGG数据库中对上述获得的unigene进行注释,分别有41 480、32 848、37 500、35 394、18 318、35 394和27 009个unigene获得注释。基因表达差异分析显示,在湖栖鳍虾虎鱼卵巢和精巢中存在10 954个差异基因(different expression gene,DEG),其中2 383个DEG表达水平在精巢中上调,8 571个DEG在卵巢中上调。对14个DEG进行实时荧光定量PCR (qPCR)验证,结果显示,qPCR结果与RNA-Seq分析一致。在差异基因中,筛选到了部分参与配子发生与成熟的基因,包括foxl2、dmrt1、cyp19a1a、inha、inhb、sycp2、zglp1、tdrp、zps和esra。差异基因富集结果中包含"泛素介导蛋白水解"、"卵母细胞减数分裂"、"孕酮介导卵母细胞成熟"、"p53信号通路"、"类固醇激素合成通路"和"PI3/AKT信号通路"等参与性腺发育及繁殖的KEGG通路。最后,从湖栖鳍虾虎鱼性腺转录组中共获得38 550个简单重复序列标记(simple sequence repeats,SSR)和192 450个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)标记。研究结果有助于对湖栖鳍虾虎鱼性别相关基因的功能研究和性别相关分子标记的开发。     

半滑舌鳎甲状腺激素受体β基因(TRβ)的克隆与表达分析

甲状腺激素在鲽形目仔鱼的变态过程中起着重要的作用,而甲状腺激素的生物效应是由甲状腺激素受体(thyroid hormone receptors,TRs)介导的。本研究利用RACE技术克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)TRβ基因的全长,并对其功能进行了生物信息学分析。结果显示,TRβ基因(GenBank登录号:No.KJ499433)cDNA全长为2 345 bp,开放读框(open reading frame,ORF)长1 188 bp,编码396个氨基酸,5'-UTR和3'-UTR分别长454和703 bp。通过氨基酸序列比对发现,TRβ氨基酸序列铰链区有一段由9个氨基酸残基组成的插入序列,推测这段序列可能为硬骨鱼类TRβ基因所特有的。实时荧光定量PCR技术分析结果显示,TRβ基因在各组织中均有表达,且在肝组织中的表达量显著高于其他组织(P0.05);因此推测TRβ基因在半滑舌鳎成鱼各组织中具有多样性的功能,而且其在肝脏的新陈代谢中起到重要的调节作用。在半滑舌鳎仔鱼变态时,TRβ基因的表达量随变态开始而迅速增加,在变态高峰期到达最高。药物处理实验结果显示,正常变态和提前变态的仔鱼TRβ基因的表达水平均随变态开始而迅速上调,而变态被抑制的仔鱼中TRβ基因的表达量则未出现显著变化,表明TRβ是调控半滑舌鳎仔鱼变态过程的重要基因,在半滑舌鳎生长发育早期阶段起较关键作用。本研究为深入解析半滑舌鳎变态的分子机制提供了理论依据和参考。