青天葵1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因片段的鉴定和分析

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase,DXS)是植物萜类MEP生物合成途径的第一个限速关键酶,提高其编码基因的表达可提高植物萜类化合物的含量。该研究在青天葵全转录组测序数据中获取青天葵DXS基因片段序列,利用生物信息学方法对其系统发育进化、保守功能域、理化性质、亲/疏水性、跨膜结构域、信号肽等进行分析和预测,并采用RPKM法分析其在青天葵叶片和球茎的表达量,为后期利用DXS基因调控青天葵萜类成分的生物合成提供理论依据。结果表明:NfDXS基因片段序列长度为2 154bp,编码含有718个氨基酸、分子量约为77.45kDa的亲水性蛋白,与其它DXS同源性可达80%。NfDXS具有1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶功能域,没有信号肽和跨膜结构域,二级结构表现为混合型结构蛋白质。NfDXS基因在青天葵中的表达趋势为:叶片球茎。     

青天葵EBP1基因原核表达载体的构建

[目的]构建青天葵器官大小调控基因——Erb3结合蛋白(Erb3-binding protein,EBP1)编码基因的原核表达载体,以期为通过原核表达体系鉴定该基因的功能奠定基础。[方法]将引入酶切位点的NfEBP1基因的PCR产物及表达载体pET-28、pET-16b分别进行双酶切,之后连接相应的酶切产物,热击转化到E.coli Top10细胞,通过菌落PCR、测序和酶切筛选阳性重组子。将确认的阳性重组子质粒转化至E.coli BL21表达宿主菌,并对其进行双酶切验证。[结果]构建了重组表达质粒pET-28-NfEBP1-1188和pET-16-NfEBP1-1188,其转化E.coli BL21表达宿主细胞后,分别获得含有2个载体的工程菌。[结论]该研究成功构建了青天葵EBP1基因的原核表达载体,为后续通过原核表达体系鉴定该基因的功能奠定了基础。     

丁公藤扦插繁殖与组织培养研究

为了建立丁公藤扦插繁殖和组织培养方法,设计正交实验,考察插枝长度、插枝浸润和浇灌的生根液浓度对丁公藤扦插存活及出芽的影响,考察不同种类和浓度的植物激素以及来源于不同叶位的外植体对丁公藤愈伤组织诱导的影响。根据正交试验结果,丁公藤扦插繁殖的最优条件组合为:扦插前浸润生根液浓度为15%、插枝长度为10～12 cm、扦插后浇灌生根液浓度为0.1%,扦插后第43 d的最高存活率和出芽率分别达到87.5%和50%;诱导愈伤组织的最优培养基为MS+0.25 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L6-BA+0.5 mg/L NAA+2 g/L Na2S2O3,室内培养的扦插苗第2位叶为诱导愈伤组织的最适外植体,诱导率最高达94.44%。建立了丁公藤扦插繁殖和愈伤组织诱导方法,为通过人工快繁缓解丁公藤资源紧缺提供了基础。     

濒危药用植物青天葵器官大小调控基因EBP1的克隆与分析

表皮生长因子受体3结合蛋白(ErbB3 binding protein, EBP1)是植物器官大小生长的关键调控因子。本研究应用RACE-PCR技术从濒危药用植物青天葵(Nevilia fordii (Hance) Schltr.)中克隆获得EBP1编码基因并命名为NfEBP1。该基因全长为1188 bp (Genbank登记号JN854245),编码395个氨基酸。生物信息学分析表明,NfEBP1蛋白分子量为43.4 kD,等电点为6.12,整体表现为亲水性。NfEBP1不含信号肽、叶绿体转运肽或线粒体靶向肽,整体位于细胞膜外;其二级结构由21个α-螺旋、21个延伸链、18个β-转角和28个随意卷曲构成。 NfEBP1含有PA2G4细胞增殖功能域,与其他植物EBP1有着高度的同源性,均归属APP_MetAP超级家族。 NfEBP1在青天葵不同组织均有表达,相对表达量以叶片最高,球茎次之,叶柄则最低。本研究成功克隆青天葵EBP1基因并分析其在青天葵不同组织的表达水平,为下一步利用该基因促进青天葵器官生长研究提供了基础数据。     

药用植物青天葵叶片原生质体的制备与纯化

[目的]研究青天葵原生质体的制备与纯化方法。[方法]以青天葵新鲜叶片为试验材料,以青天葵叶片原生质体产量及原生质体存活率为考察指标,研究了预处理、酶解方式、酶解温度、离心转速、光照、筛网目数等因素对青天葵原生质体分离纯化效果的影响。[结果]适宜青天葵叶片原生质体游离的条件是用浓度13%甘露醇溶液预处理叶片1 h、酶解温度（25±1）℃、黑暗、静置;原生质体纯化采用离心沉淀法,以200目筛网过滤后离心8 min（800 r/min）,操作2次,可得到大量完整清晰、细胞碎片少的原生质体。[结论]该方法获得了制备青天葵原生质体的理想条件与参数,为建立青天葵原生质体再生体系提供了依据。     

大气压等离子体处理对穿心莲种子萌发及幼苗的影响初报

采用大气压等离子体技术处理穿心莲种子,发芽试验和幼苗叶绿素、酶活力测定发现,不同电压和处理时间组合的大气压等离子体处理显著影响穿心莲种子发芽试验幼根长、活力指数及幼苗叶绿素、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性,但影响程度有差异,规律不明显.其中以处理电压为3400V、处理时间为60s的APP处理最有利于穿心莲种子萌发;而经5 950 V、60s的APP处理则对穿心莲种子的萌发有强烈抑制作用.     

4种溪黄草药材基原植物种子状果实形态特征的比较

本研究采用体视镜和扫描电镜相结合的方法,对4种溪黄草药材基原植物种子状果实的形态特征进行观察比较。线纹香茶菜、纤花香茶菜及长叶香茶菜种子状果实的形状特征相似,呈卵型,大小为0.88~1.17 mm×0.54~0.77 mm,大小顺序依次为线纹香茶菜>纤花香茶菜>长叶香茶菜;表面具有网状纹饰,但网壁隆起高度不同,高度依次为线纹香茶菜>纤花香茶菜>长叶香茶菜;遇水后出现粘液质,其中线纹香茶菜与纤花香茶菜的果实均具有较多粘液质,长叶香茶菜只有少数果实具有粘液质,且量多少不一。溪黄草种子状果实形态特征与上述3种植物明显不同,呈阔卵圆型,大小为1.24~1.60 mm×0.89~1.33 mm;种子状果实表面的网状纹饰粗糙且多皱缩,具有散在的腺点和白色非腺毛,多分布于顶端,由1~3个细胞组成;遇水后无粘液质出现。结果表明,上述4种植物种子状果实在形状、大小、表面纹理及粘液质有无等方面存在较为明显的差异。种子状果实形态特征的差异可为4种植物提供一定的分类依据。     

鸡血藤及其混伪品matK基因分析和分子鉴定

以鸡血藤及其4种常见混伪品为试材,采用植物基因组DNA提取试剂盒提取鸡血藤样品总DNA,并采用matK基因通用引物扩增和测序,从GenBank获取鸡血藤4种混伪品的matK基因序列,采用DNAMAN、MEGA等生物软件比对分析序列差异,计算遗传距离并构建聚类树,研究matK基因对鸡血藤及其混伪品的鉴别效果。结果表明:获得的鸡血藤及其混伪品matK序列长度为690bp,平均GC含量为31.1%,共发现236个差异位点,占总碱基数的34.2%。8个鸡血藤样品matK序列在41bp处存在A-G碱基差异。鸡血藤与混伪品之间的种间变异大于鸡血藤样品内的变异。基于matK基因序列建立的聚类树能够明显地鉴别鸡血藤及其混伪品。matK基因可作为鉴别鸡血藤及其混伪品的标准DNA序列。     

白木香叶片外植体愈伤组织诱导研究

以白木香叶片为试材,研究了叶龄、外植体大小、外植体接种方式、光照和激素浓度及组合等因素和水平对愈伤组织诱导的影响.结果表明:选择叶龄为12 d的叶片剪成0.5 cm2大小,以正面向上的方式接种在MS+2,4-D 1.0 mg/L+ZT 1.0 mg/L培养基中,黑暗培养,愈伤组织诱导率达100％.     

青天葵NfD53基因的克隆及生物信息学分析

本研究克隆青天葵NfD53基因并分析其序列特征,可为今后深入研究NfD53蛋白功能及独脚金内酯(SLs)对植物侧枝生长发育的影响提供参考依据.以濒危药用植物青天葵叶片为实验材料,利用RT-PCR及RACE技术克隆获得2条NfD53基因,分别命名为NfD53-1和NfD53-2,应用生物信息学软件分析其序列并进行功能预测.结果 显示:NfD53-1基因全长3523 bp,编码974个氨基酸;NfD53-2全长3916 bp,编码1190个氨基酸.两者等电点分别为:8.34、6.33;亲水性平均数为:-0.250、-0.263;均为不稳定的亲水性蛋白,无信号肽及切割位点,定位于叶绿体.两蛋白都具有ClpA超家族核心序列,而NfD53-1蛋白还具有ClpC超家族核心序列,并含有3个非特异性位点(ClpA,ClpC和AAA_2),NfD53-2蛋白含有1个ClpA非特异性位点.蛋白的二级结构中均以无规则卷曲占比最高,分别占47.16％和51.21％;其次是α-螺旋,占38.70％和31.69％.系统进化分析表明,NfD53-1与番茄等聚为一支,但氨基酸相似度较低(20.27％),NfD53-2与铁皮石斛聚为一支,同源性较高(66.49％).本研究为后续进一步探讨该基因的功能及SLs在植物生长发育中的作用提供数据参考.