PCV2衣壳蛋白羧基端基因在T4噬菌体表面的展示及ELISA方法的建立

用PCR扩增猪圆环病毒Ⅱ型广东分离株的衣壳蛋白羧基端基因,将PCR产物连接到pR质粒,转化DH5α细胞,筛选阳性克隆进行PCR鉴定并测序后,转化E2菌,将重组E2菌与缺陷型噬菌体T4-Z1同源重组后,得到重组噬菌体,经SDS-PAGE和Western blotting分析,表明衣壳蛋白片段在噬菌体表面正确展示,表达的融...     

两广地区2011--2012年H9N2亚型禽流感病毒的HA基因进化分析

为探究两广地区H9N2亚型禽流感病毒（avianinfluenzavirus,AIV）的变异情况及分子流行规律,于2011-2012年从该地区发病鸡群中共分离到16株H9N2亚型A1V,并对分离株HA基因进行测序与进化分析。结果表明,分离株HA基因开放阅读框全长均为1683bp,编码560个氨基酸;HA基因核苷酸同源性为88．7％～99．6％,编码氨基酸同源性为91．8％～99．5％。本试验分离毒株与国内疫苗株（GD-SS、SH—F和SD-6）的核苷酸同源性在90．1％～92．6％之间,推导的氨基酸序列同源性在91．6％～94．8％之间。进化分析显示分离株可分为Group1和Group2两个亚分支,与疫苗株均属于欧亚谱系的Y280分支,但亲缘关系较远。分离株HA蛋白裂解位点附近序列有3种形式：PARSSR＋GLF、PSRSSR＋GLF和PARLSR0GLF,均无连续碱性氨基酸的插A,符合低致病性AIv的特征。本试验发现分离株GD4、GX2在HA1的127、295位分别增加一个潜在的糖基化位点;除分离株GD5和GD6外,其余分离株在HAl的216位发生Q216L氨基酸突变,表明其存在感染人的可能性。     

H1亚型猪流感病毒广东株HA基因的原核表达

为了研制猪流感检测试剂和流感亚型特异性单抗筛选所需的重组抗原,本研究克隆和原核表达了H1N1亚型猪流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)基因.首先采用RT-PCR方法扩增了H1亚型猪流感病毒(SIV)广东株的HA基因.测序结果表明,扩增的SIV HA基因cDNA长度为 1 701 个核苷酸,共编码566个氨基酸.BLAST分析表明,H1N1亚型SIV广东株HA基因核苷酸序列与GenBank中已发表的中国香港特别行政区、中国大陆、美国分离的经典H1亚型毒株相近,核苷酸序列同源性在89%以上.然后将HA基因的cDNA片段亚克隆至pET32a( )表达载体中,构建重组质粒pET32a-H1,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达.SDS-PAGE和凝胶扫描分析表明,HA基因在大肠杆菌中获得了高效表达,重组融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的25.2%.经免疫印迹证实重组蛋白可以被SIV特异性抗体所识别.     

堆型艾美球虫3-1E基因在大肠杆菌中的可溶性表达及鉴定

将堆型艾美球虫（E．acervulina）3-1E基因克隆至pET-32a（＋）载体中。转化大肠杆菌BL21，在37℃下，用终浓度为1.0mmol／L的IPTG诱导表达，得到相对分子质量约为38500的重组蛋白。Western blot检测证实，该重组蛋白可以与特异性抗血清结合。在20℃条件下，以终浓度分别为2．0、1．0、0．5mmol／L的IPTG进行诱导．当IPTG终浓度为0．5mmol／L时，以可溶性形式存在的目的蛋白含量最高。     

2011—2015 年我国南方地区PEDV 分子流行病学调查及S 基因遗传变异分析

应用RT-PCR方法对南方地区五省(广东、广西、福建、四川、江苏)18个猪场7日龄以内发病仔猪的小肠组织和粪便样本进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测,对9个猪场进行为期5年的动态监控,并对2011-2015年期间分离的35个PEDV流行株的S基因进行测序,与GenBank中的PEDV参考序列进行比较,并绘制了系统进化树.结果显示,上述地区五省存在Group1和Group 2两种类型毒株.Group1与美国、韩国毒株较为接近,可分为G1-1、G1-2、G1-3和G1-4等4个亚群,Group 2与2004年国内分离毒株较为接近,可分为G2-1、G2-2两个亚群.25个中国南方地区毒株集中于G1-2和G1-3,而另外8株与2004年国内毒株(JS-2004-2)同属G2-2亚群.不同类型的毒株引发的PEDV临床表现及死亡率不同,G2-2亚群的毒株引发的PED相对缓和,死亡率较低且病程较短,而位于G1-2和G1-3亚群(尤其是G1-3)的毒株则引起大规模急性暴发,病程较长,死亡率较高.     

重组鸭β-防御素-2制剂对樱桃谷肉鸭免疫性能及肠道绒毛的影响

试验旨在研究重组鸭β-防御素-2制剂对肉鸭免疫性能与肠道绒毛的影响。将1 000只11日龄肉鸭随机分成5个处理组,每处理组4个重复,每重复50只肉鸭。A组为对照组,饲喂基础饲粮;B组在基础饲粮中添加500 g/t杆菌肽锌;C、D和E组分别在基础饲粮中添加300、450和600 g/t的重组鸭β-防御素-2制剂。试验结果表明:胸腺指数,E组显著高于A、B和C组(P<0.05);A和D组均显著高于B和C组(P<0.05);其余各组差异不显著(P>0.05)。脾指数各组间均无显著性差异(P>0.05)。法氏囊指数,除E组显著高于A组外(P<0.05),其余各组无显著性差异(P>0.05)。随重组鸭β-防御素-2制剂添加量的增加,胸腺指数、脾指数及法氏囊指数均有增加的趋势。禽流感疫苗抗体效价E组显著高于A和B组(P<0.05),其余各组均无显著性差异(P>0.05)。随重组鸭β-防御素-2制剂添加量的增加,禽流感抗体效价也有增加的趋势。十二指肠绒毛高度,C和D组均显著高于A和B组(P<0.05)。空肠绒毛高度,A组显著高于B、C、D和E组(P<0.05)。十二指肠与空肠隐窝深度均无显著性差异(P>0.05)。试验结果表明:重组鸭β-防御素-2制剂能提高肉鸭的免疫性能与肠道绒毛的高度。     

PCV2衣壳蛋白羧基端基因在T4噬菌体表面的展示

用PCR扩增猪圆环病毒II型广东分离株的衣壳蛋白羧基端基因,将PCR产物连接到重组型质粒pR上,转化DH5α细胞并筛选阳性克隆;重组质粒经PCR鉴定并测序后,转化E2菌,将重组E2菌与缺陷型噬菌体T4-Z1同源重组后,得到重组噬菌体,SDS-PAGE和Westernbloting分析,表明衣壳蛋白基因在噬菌体表面正确展示,表达的融合蛋白的分子量约为25Ku。     

猪A型塞内卡病毒感染诱导猪肾细胞(PK-15)长链非编码RNA差异表达谱的分析

为研究猪A型塞内卡病毒(SVA)感染猪肾细胞(PK-15)后对于PK-15 lncRNA表达谱的影响,本研究进行了高通量测序以检测SVA感染诱导PK-15产生的差异表达lncRNA。结果显示,在SVA感染后24 h,共诱导1043个lncRNA差异表达,其中已知的lncRNA 420个,未知的lncRNA 623个。GO富集和KEGG通路分析显示,lncRNA靶基因富集于p53信号通路、RIG-I样受体信号通路、MAPK信号通路、IgA生成的肠道免疫网络通路等。根据高通量测序结果选择了8个差异表达的lncRNA采用荧光定量PCR验证,验证结果与高通量测序结果一致。本研究初步表明lncRNA参与了SVA对PK-15细胞的感染过程,为SVA的分子机制研究提供了新的方向。     

鸡β-防御素基因的克隆与结构分析

通过RT-PCR扩增出鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的部分cDNA序列，大小分别为198、195和297bp。利用PCR技术扩增出鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因组DNA部分序列，大小分别为1176、1053和2454bp。经分析发现，2个内含子将鸡-β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的编码区分成3个外显子部分。第1个外显子编码绝大部分信号肽序列；第2个外显子编码信号肽羧基端极小部分序列、原片段序列与大部分成熟肽序列；第3个外显子编码小部分成熟肽序列。扩增到的鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的两个内含子长度，分别为482和496bp，183和675bp，980和1280bp。鸡β-防御素基因编码区结构的这种组成与哺乳动物的β-防御素基因的不同，在哺乳动物中为1个内含子将β-防御素基因编码区分成2个外显子部分。Blast比较发现，鸡β-防御素Ga1-1和Ga1-2基因位于鸡的3号染色体连续克隆群Contig42．182上，并且这2个基因转录方向相反。Ga1-3基因位于鸡的3号染色体连续克隆群Contig42．181和Contig42．182上，转录方向与Ga1-1基因相同。