桃PGIP蛋白基因片段的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达

 【目的】克隆桃（Prunus persica）多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonase-inhibiting protein，PGIP）基因，并进行原核表达研究。【方法】根据李属植物pgip保守区域设计1对特异引物，以桃叶片总RNA为模板，通过RT-PCR获得了约1 kb的cDNA片段，T/A克隆后进行序列测定，并对该序列进行分析。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pET-32a(+)中，构建融合表达质粒，转化到Escherichia coli Rosetta-gami（DE3）pLysS中进行表达。【结果】测序结果显示，桃多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白cDNA编码区长993 bp，编码330个氨基酸残基，命名为Pppgip。PpPGIP分子量为36.4 kD，等电点为7.42，信号肽为N端24个氨基酸残基，具有7个潜在的N-糖基化位点。Pppgip与李属其它pgip核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为93.2%～94.6%和89.7%～92.7%。同源树分析表明，该基因明显区别于其它pgip，与马哈利樱桃pgip的关系较近，与寿星桃、桃栽培品种‘久保’等pgip的关系都较远。该基因所编码的蛋白质的三维结构含11个α-螺旋和21个β-折叠，中心LRR结构域由10个串联的LRRs基序组成。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明，重组蛋白主要以包涵体形式出现。【结论】克隆了桃PGIP基因，并可在大肠杆菌中表达。     

中矮1号梨砧木(S_2)PGIP基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,根据GenBank中梨属PGIP基因序列设计1对特异引物,以梨矮化砧木S2叶片总RNA为模板,克隆到1条约1100bp的cDNA片段,将其与pMD18-Tvector连接后转化Escherichia coli JM109,对筛选到的阳性克隆进行序列测定并使用生物信息学方法对所得结果进行综合分析。结果表明,克隆片段为梨PGIP基因,该cDNA编码330个氨基酸,预测分子量为36388ku,第1～24个氨基酸残基是信号肽。与梨属其它种中已获得的PGIP核苷酸序列开放阅读框(Open reading frame,ORF)的同源性为97.5%～99.6%,氨基酸序列的同源性为97.6%～99.1%。