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多位点基因打靶技术的鳜鱼体内实验研究 总被引:1,自引:0,他引:1
在转基因动物的研究中,一般采用随机插入的方法。基因在受体动物的基因组中随机整合,严重制约了转基因动物外源基因的稳定遗传,是转基因动物研究亟待解决的问题。转基因定点整合技术,即基因打靶技术是解决上述问题的重要途径,但是基因打靶存在打靶效率太低的问题。本研究小组已建立了体外动物细胞的多位点基因打靶技术,并构建了用于鳜鱼的体内多位点基因打靶的打靶载体,本文开展多位点基因打靶技术的鳜鱼体内实验研究。以鳜鱼rDNA基因(编码rRNA的基因)及其间隔序列作为同源重组引导序列,构建含干扰素基因的打靶载体,以其间隔序列为靶位点,针对鱼类胚胎发育特点,采用精子介导技术进行多位点基因打靶,最终获得定点整合干扰素基因的鳜鱼,并建立一套适用于动物的基因定点敲入的体内基因打靶技术。主要研究内容如下:(1)采用组织培养方法,获得鳜鱼头肾淋巴细胞和脾淋巴细胞,采用脂质体介导法使多位点基因打靶载体在鳜鱼的细胞上实行基因转移。采用正负筛选方法,利用筛选药物G418和GCV(更昔洛韦)筛选转染后的细胞两周后,对存活细胞进行DNA水平和RNA水平鉴定。结果证明了干扰素基因在鳜鱼细胞上实现了定点整合和稳定表达。(2)利用精子介导法将经线性化处理后的多位点基因打靶载体在鳜鱼的胚胎上实行基因转移。(3)根据靶位点定点整合的正负筛选原理,利用筛选药物G418和GCV筛选与富集定点整合后的阳性鱼胚或鱼苗,结果成功孵化出106尾转基因鳜鱼鱼苗。(4)培育6个月后,取20尾转基因鳜鱼进行鉴定。采用PCR、RT-PCR、测序等方法进行定点整合的鉴定。结果表明:6尾检测到已转入的基因——干扰素基因,其中有3尾实现了定点整合并表达。本研究率先将多位点基因打靶技术应用到转基因鱼的研究中,建立一套适用于鱼类的高效、安全的多位点基因打靶技术,并获得外源基因定点整合并表达的鳜鱼。 相似文献
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超级稻DAD1基因的cDNA克隆及其正反义表达载体的构建 总被引:1,自引:1,他引:0
采用RT-PCR方法从超级稻幼苗中扩增DAD1基因的cDNA,并克隆测序,核酸序列表明该基因编码区为342bp,编码114个氨基酸残基.与GenBank发表的序列(XM_472334)相比,有3处碱基不同,分别为105bp处的C(GenBank的为T),148bp处的A(G),149bp处的C(T).将该基因分别正向和反向插入CaMV35S启动子后,构建了基因在植物中的正义、反义表达载体. 相似文献
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家禽转基因技术的分类方法与存在的问题 总被引:1,自引:0,他引:1
1993年英国Sang博士将外源基因导入公鸡,首次获得了蛋黄中含有珍贵的人类蛋白的母鸡犤1犦。由于家禽的繁殖周期短,产蛋量高,且转基因产品具有巨大的潜在价值,因此,转基因家禽是一种理想的输卵管生物反应器犤2犦。但由于母禽的生殖生理系统特殊,家禽为体内受精,受精后在卵子周围形成卵白、壳膜及蛋壳,同时受精卵发生快速分裂,受精蛋约20h后产出体外时,胚胎已发育到6000个细胞。因此,对家禽进行早期遗传操作十分困难,以致于在哺乳动物上已经成熟的转基因方法在家禽上却不能发挥有效的作用,使得转基因家禽的生产相对落后于哺乳动物。因此,家禽… 相似文献
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【目的】明确藏猪和杜藏猪(杜洛克父本与藏猪母本杂交F1代)的生长和胴体性状及肉质指标等表型差异,并分析背最长肌中脂肪沉积相关基因的表达差异,为藏猪种质资源利用及猪脂肪沉积规律研究提供参考依据。【方法】以藏猪和杜藏猪为研究对象,分别测定其体长、体高和胸围等生长性状,屠宰率、背膘厚及眼肌面积等胴体性状,以及pH、肉色、蒸煮损失及肌内脂肪含量等肉质指标;并通过荧光实时定量PCR检测脂肪沉积相关基因在2种猪背最长肌中的表达情况。【结果】杜藏猪的左胴体重、右胴体重、屠宰前重、胴体长、体长、体高、管围和胸围均高于藏猪,且差异显著(P<0.05,下同),眼肌面积(33.00±3.84 cm2)也显著大于藏猪(16.83±1.81 cm2),背膘厚(13.15±2.48 mm)则显著低于藏猪(22.83±2.80 mm),藏猪与杜藏猪的皮厚、腹围和屠宰率无显著差异(P>0.05,下同);杜藏猪肌肉的pH-24 h、熟肉率、剪切力和含水率显著高于藏猪肌肉,而杜藏猪肉色的a-24 h值(10.30±1.06)和肌内脂肪含量[(2.48±1.44)%]显著低于藏猪。除GHR基因外,其他脂肪沉积相关基因的相对表达量均表现为杜藏猪低于藏猪,其中,ADIPOQ基因和FASN基因的相对表达量显著低于藏猪,IGF1基因、TNFa基因和Leptin基因的相对表达量极显著低于藏猪(P<0.01)。相关分析结果显示,GHR基因相对表达量与杜藏猪肌内脂肪含量呈显著正相关,FASN基因相对表达量与藏猪肌内脂肪含量呈显著正相关,IGF1基因相对表达量与藏猪背膘呈显著负相关。【结论】杜藏猪的肉质性状与藏猪相似,但杜藏猪具有更佳的生长性能,说明以杜洛克为父本与藏猪母本杂交得到的杜藏猪具有更优的生产效率。藏猪和杜藏猪的肌内脂肪含量差异与脂肪沉积相关基因的表达差异有关,即猪的肌内脂肪含量受多种脂肪沉积相关基因调控。 相似文献
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亲缘生物法生物信息技术在水产基因研究中的应用 总被引:2,自引:0,他引:2
用Entrez、SRS等检索工具可从GenBank、EMBL等核酸序列数据库、鱼类专业数据库获取相关水产动物的基因等信息,通过电子邮件或网页填表等方式用BLAST、FASTA等序列分析软件来分析获得的信息,以鳜鱼rRNA基因为例,根据鳜鱼的分类树,按种、属、科、亚目、目、总目追级向上寻找亲缘关系较近的其它鱼类的rRNA基因,直到找到有价值的rRNA基因序列。将有价值的rRNA基因序列拼接成重叠群,根据重叠群设计引物、克隆鳜鱼的rRNA基因,获得鳜鱼的3个rRNA基因及其间隔序列。为经济动物的基因研究建立了一种亲缘生物法的生物信息学技术。 相似文献