香蕉束顶病毒海口分离物NSP基因的原核表达

应用PCR方法从感染香蕉束顶病毒的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中克隆NSP (Nuclear shuttle protein)基因的编码区,并通过Gateway技术定向重组到原核表达载体pDEST~(TM)-17中的6xHis标签下游,经菌落PCR和测序鉴定结果表明,成功构建了原核表达载体pDEST~(TM)-17-NSP.阳性克隆转化Ecoli BL21(DE3),经IFFG诱导表达、SDS-PAGE分析和western blot检测,结果显示,融合蛋白以包涵体的形式稳定表达,分子量约为20 ku,与预计值相符.通过诱导条件的优化,确定了最佳的融合蛋白表达条件为25℃、0.1 mmol/L IPTG条件下诱导4h.从而为制备NSP多克隆抗体和进一步研究NSP的功能奠定了基础.     

香蕉束顶病毒海口分离物Rep基因的克隆、原核表达、抗血清制备及检测

［目的］ 对香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)海口分离物起始蛋白(replication initiation proteins, Rep)基因进行克隆、原核表达、抗血清制备,为BBTV有效的检测及分子流行病学等研究奠定基础。［方法］ 以海口地区染病香蕉幼嫩假茎和叶片的总DNA为模板,通过PCR技术克隆BBTV海口分离物的起始蛋白基因,连接到表达载体并进行大肠杆菌原核表达,制备高效价特异性抗血清。［结果］ 应用PCR方法从染毒香蕉幼嫩假茎和叶片总DNA中扩增复制rep基因,回收目的片段后经酶切,获得了含BBTV Rep基因的重组质粒pET32b Rep。将重组质粒转化E.coli BL21(DE3),经不同的时间、温度及IPTG浓度优化,12% SDS PAGE电泳分析,在20 ℃、0.1 mmol/L IPTG条件诱导4h,最终获得大量的可溶性融合蛋白。将可溶性蛋白上清液经Ni2+ NTA亲和层析柱纯化,得到高纯度的融合蛋白。用纯化后的融合蛋白免疫家兔,获得了BBTV Rep蛋白抗血清。以融合蛋白做抗原,间接ELISA法测定抗血清效价大于125 000。以田间样品做抗原时,结果表明抗血清最佳工作浓度为1∶1 000。Western blot鉴定结果表明抗血清能与融合蛋白特异性结合。［结论］ 利用Rep基因制备的特异性抗血清在BBTV病毒粒体的组装机制研究及病毒病诊断上具有重要的应用价值。     

黄瓜花叶病毒2b基因在大肠杆菌中的表达及其自激活特性检测

2b蛋白是黄瓜花叶病毒与植物寄主相互作用的一种重要多功能蛋白。用PCR方法扩增目的基因2b,经酶切、连接将其克隆至带有λcI基因的pBT载体上,构建与λcI基因融合的表达载体pBT-CMV 2b,转化大肠杆菌XL1-Blue MRF′报告菌株,用IPTG诱导表达黄瓜花叶病毒2b基因。Western blot分析结果表明,2b-λcI融合蛋白已成功表达,大小约为38 ku,与预期大小一致。pBT-CMV 2b与空质粒pTRG共转化XL1-Blue MRF′报告菌株,同时以pBT空质粒和pTRG-Gal11p共转化作为对照。结果显示,CMV 2b蛋白未产生自激活作用,从而为利用大肠杆菌双杂交系统筛选与2b蛋白相互作用的蛋白质研究奠定基础。     

香蕉束顶病毒海口分离物基因组的克隆及序列分析

 以海口香蕉束顶病株的幼嫩假茎和叶片总DNA为模板,通过反向PCR法克隆了香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)海口分离物(命名为BBTV-HaiKou)的6个DNA组分的全长序列。结果表明,DNA1~6序列全长分别为1106、1040、1058、1040、1013和1082nt。各组分非编码区各包含一个茎环共同区和一个主要共同区,同源性分别为91.55%和88.45%。各组分编码区均编码一个开放可读框(ORF),其中DNA1 ORF内部还有一个小的ORF。序列分析表明,BBTV-HaiKou分离物与其它分离物间的DNA1最为保守,DNA2变异最大。DNA1组分核苷酸序列与亚洲组、南太平洋组各分离物及ABTV (Abacá bunchy top virus)分离物同源性分别为93.1%~99.1%,89.6%~90.7%和76.2%~77.4%,相应的编码蛋白氨基酸序列同源性在BBTV和ABTV中分别为93.4%~100%和85.7%。根据Karan等的分类方法,确定BBTV-HaiKou分离物属于亚洲组成员。     

海南胡椒中黄瓜花叶病毒分离物的分子鉴定

通过间接酶联免疫法,从海南罹病胡椒植株中检测到黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV).从病叶中提取总RNA,用巢式RT-PCR方法扩增获得657 bp的CMV CP基因片段,并与pMDl8-T载体连接和转入大肠杆菌克隆,然后进行测序.序列分析结果表明,该分离物与CMV亚组I、亚组II之间的核苷酸序列同源性分别为92.54%～99.09%和76.97%～77.42%,推导氨基酸序列同源性分别为98.17%～100%和81.74%～82.65%.该分离物CP基因与印度胡椒分离物同源性相对较低,应属不同株系.     

香蕉束顶病毒海口分离物Rb蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗血清制备

应用PCR方法从感染香蕉束顶病毒的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中克隆了Rb(Rb-binding-like protein)基因的编码区,将其插入原核表达载体pET-28b中构建重组质粒pET28b-Rb。转化重组质粒的E.coli BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析结果表明,表达产物大小为22.6ku,且主要以包涵体形式稳定表达。目的蛋白经Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化后免疫家兔并获得抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的BBTV编码Rb蛋白发生特异性反应。间接ELISA法测定的抗血清效价大于1:250000。用抗血清对感病香蕉和健康香蕉进行检测,结果表明,抗血清对感病香蕉有很高特异性,最佳工作浓度为1:1500。     

辣椒脉斑驳病毒CP基因的原核表达及其抗血清的制备

采用RT-PCR方法克隆了辣椒脉斑驳病毒文昌分离物（ChiVMV-WC）的CP基因,并将其连接到原核表达载体pET-30b（+）上,克隆测序以确定其阅读编码框的正确性,然后将获得的重组质粒pET30b-ChiVMV CP转化大肠杆菌Rosetta（DE3）后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,获得的融合蛋白分子量约为38 kD。用Ni2+-NTA 琼脂糖亲和层析纯化的融合蛋白免疫兔子并获得抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的ChiVMV-WC编码CP蛋白发生特异性反应。间接酶联免疫吸附法（ID-ELISA）检测抗血清效价为1/106。通过对田间20个样品的ID-ELISA检测,证实了所制备的抗血清与ChiVMV病叶具有良好的反应特异性。     

黄瓜花叶病毒NASBA检测技术的建立

 以香蕉花叶病病样为材料,初步建立了黄瓜花叶病毒核酸序列依赖性扩增(Nucleic acid sequence based amplifica-tion,NASBA)的检测技术。通过以香蕉叶片总RNA为模板,在黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)亚组ⅠRNA 2高保守区设计特异引物,进行NASBA反应,经5%琼脂糖凝胶电泳检测,阳性样品中出现了预期大小为310 bp的条带,而阴性和空白对照中均未出现。并对11份香蕉样品分别进行NASBA反应,并经过斑点杂交验证与RT-PCR检测比较,两者的检测结果一致,灵敏度相当,检出限量可达100 pg。     

香蕉束顶病毒海口分离物CP基因的原核表达、纯化及其抗血清制备

用PCR方法从感染香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中扩增外壳蛋白(coat protein,CP)基因。回收目的片段,经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后与同样酶切的质粒载体pET30a(+)相连接,酶切验证及测序结果获得了含BBTV CP基因的重组质粒pET30a-CP。将重组质粒转化Codon plus表达菌,在25℃、0.4mmol/L IPTG条件下诱导6h或过夜,经12%SDS-PAGE电泳分析可知,该重组菌表达了一个与预期分子量大小一致的His-CP融合蛋白,约为30ku,且主要以包涵体的形式存在。多次洗涤包涵体后得到高纯度的融合蛋白,用其免疫家兔,获得BBTV CP蛋白抗血清。间接ELISA法测定抗血清效价大于51200。Western blot分析表明,抗血清能与融合蛋白特异性结合。