喜树丛枝植原体的分子鉴定及TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

 为确定在云南文山地区喜树上发生的疑似丛枝病的病原种类及快速检测喜树丛枝病,本研究利用植原体16S rDNA基因通用引物P1/P7和R16F2n/R16R2对感病喜树总DNA进行常规PCR和巢式PCR扩增、克隆和测序,通过系统进化分析,明确了喜树丛枝植原体属于16SrXXXII组。然后根据喜树丛枝病植原体16S rDNA基因保守区域设计并合成特异性引物和TaqMan探针,制备了喜树丛枝病植原体标准质粒,确定了最优引物浓度和最佳探针浓度,制作的标准曲线有极好的线性关系,决定系数(R²)达到0.999,建立的实时荧光定量PCR检测方法能够特异性地检测喜树丛枝植原体。本研究首次明确了喜树丛枝植原体的分类地位,优化和建立了喜树丛枝植原体TaqMan探针qPCR检测方法,为快速检测喜树丛枝病植原体提供参考。     

云南花生丛枝植原体16S rRNA和核糖体蛋白基因序列分析

 利用植原体16S rRNA基因及核糖体蛋白基因(ribosomal protein, rp)通用引物对发生在云南元谋的花生丛枝病病株DNA进行PCR扩增,并对扩增片段进行序列测定。扩增获得的云南元谋花生丛枝植原体(PnWB-YNym)16S rDNA、16S-23S rDNA和23S DNA片段总长1 806 bp,rp基因扩增片段长1 171 bp。云南株系与来源于台湾和海南的花生丛枝植原体均有较高同源性。比较16S rDNA片段,发现云南株系在5个位点上与来自台湾或海南的株系存在碱基差异,其中有1个位点的差异是云南元谋株系特异的;再分别比较核糖体蛋白rplV-rpsC 2个基因所编码的氨基酸序列,发现云南株系rpsC编码的第194位氨基酸与台湾和海南的株系存在差异。经16S rDNA片段系统进化及iPhyClassifier在线分析,表明PnWB-YNym在分类上属于16SrII-A亚组成员,与候选种‘Candidatus Phytoplasma australasiae’相关;基于rp基因构建的系统进化树表明,PnWB-YNym与16SrII-A亚组各成员聚为同一亚进化支(iii)。     

三七种植前后土壤营养、酶活性与微生物群落结构的变化研究

【目的】明确三七连作对土壤养分、酶活性及微生物群落结构的影响,为克服三七连作障碍提供有效的策略。【方法】结合高通量测序技术,分析种植年限的延长对三七根际土壤真菌群落、细菌群落影响的相关性。【结果】随着种植年限的延长,土壤pH值、有机质、全钾、速效磷、速效钾含量上升,而全氮、全磷、碱解氮含量下降;土壤酶活性除碱性磷酸酶变化不大外,脲酶、蔗糖酶、多酚氧化酶均明显下降。高通量测序表明,三七种植前后土壤在科水平上检测分类出占比较高的真菌15类、细菌16类,其中,对照土壤中真菌主要以Hygrocybe为优势菌种,占比为55.17%;种植三七后土壤中真菌占比降至0.37%,Fusarium为优势菌种,占比为8.31%,其百分比含量增加32倍;种植三七后土壤中的细菌群落组成与种群密度变化明显,Pseudomonas、Streptomyces等生防细菌随着三七种植年限的延长呈下降趋势。【结论】随着三七种植年限的延长,土壤微生物的多样性总体呈上升趋势,土壤酶活性下降,土壤营养失调。     

羽脉山黄麻丛枝病感病植株内源激素含量水平的变化

【目的】明确植原体诱发的羽脉山黄麻丛枝病发病和无症状枝叶间六大类植物内源激素含量水平的差异,为羽脉山黄麻丛枝病发病机理的研究奠定基础,为该病害的防治提供理论依据。【方法】野外采集位于云南省新平县同一植株上表现为典型丛枝症状的感病样品和形态正常的健康样品,采用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)法定性定量检测样品中六大类(生长素、细胞分裂素、脱落酸、茉莉酸、水杨酸、赤霉素)共25种植物激素的含量水平。【结果】共检测到24种激素,H2JA在健康和感病样品中均未检测到,cZ在感病样品中未检测到,GA_(19)只在感病样品中检测到,GA_(20)、GA_(24)、GA_(53)只在健康样品中检测到。其中MESA含量最高,IAA、IBA、ICA、MEJA、JA、JA-ILE、MESA、SA、ABA等9种激素含量在感病样品和健康样品间存在极显著差异,IP和tZ存在显著差异。赤霉素中GA_3、GA_(19)、GA_(20)、GA_7、GA_9、GA_(15)含量水平变化较大。感病样品六大类植物激素含量水平总体下降明显,C/A比值升高。【结论】研究表明感染植原体的羽脉山黄麻丛枝体内植物内源激素含量水平发生了明显变化。该植原体病害的主要症状为丛枝小叶,是各种致病因子综合影响的结果,其中哪些激素水平的失衡为主要致病因子,还需进一步研究。     

基于线粒体COⅠ基因及形态特征的喜树丛枝植原体主要媒介昆虫种类鉴定

植原体病害是喜树上危害最严重的病害之一,传播喜树植原体病害的主要媒介昆虫是喜树上的一种小绿叶蝉,为进一步分析媒介昆虫传播植原体机制以及植原体在昆虫体内的侵染循环过程,为植原体病害的科学防控提供参考,媒介昆虫的种类及分类地位必须先行明确。通过网捕法采集云南文山喜树上的小绿叶蝉标本,在体视显微镜下根据各龄期外部形态以及雄性外生殖器特征进行种类鉴定,结合PCR扩增线粒体COⅠ基因序列片段进行测序和比对,利用Kimura 2-parameter模型计算出平均遗传距离并用最大似然法构建系统发育树,进一步明确其分类地位,再根据前人制作的属及亚属分类检索表明确其分类地位。共检视并解剖小绿叶蝉雄虫标本100余头,提取20余头DNA进行测序,得到16条709 bp大小的COⅠ基因序列片段,结合NCBI上相关的叶蝉COⅠ序列,建立基因进化树。综合分析其外部形态、雄性外生殖器特征以及COⅠ序列比对,明确了喜树丛枝植原体主要媒介昆虫是拟帕小绿叶蝉Empoasca(Matsumurasca)paraparvipenis Zhanget Liu-CA,分类地位为小绿叶蝉属Empoasca Walsh, 1862,...     

云南蔓草虫豆丛枝植原体rp基因序列分析及结构预测

为了从亚组水平上明确云南元谋县的蔓草虫豆丛枝植原体的分类地位,本研究以rp(Ⅱ)F1/rp(Ⅱ)R1为引物,利用PCR对感病蔓草虫豆总DNA进行rp基因扩增.扩增产物进行序列分析和编码蛋白特性预测,并通过生物信息学软件对rp基因编码的rp122、rps3蛋白特性进行分析.结果 表明,PCR扩增测序得到1171 bp的特异性片段,该片段包括全部rpl22基因和大部分rps3基因,两基因相互重叠,分别编码128和237个氨基酸.通过同源性比对及系统进化树分析,从亚组水平明确了蔓草虫豆丛枝植原体是16SrⅡ-A亚组成员,且归属于rp-iii亚进化支.预测rp基因所编码的rp122和rps3蛋白均为脂溶性蛋白,且二级结构包括螺旋、卷曲和折叠.本研究结果可为深入研究蔓草虫豆丛枝植原体蛋白跨膜运输的分子机理提供一定的理论参考.     

云南芝麻丛枝和花变叶植原体16S rRNA和rp基因序列分析

 本研究通过对表现出丛枝和花变叶症状的芝麻感病植株总DNA进行植原体16S rRNA和rp基因的PCR扩增、克隆、测序及序列分析,明确了两种病株的病原均为植原体,并将其命名为云南元谋芝麻丛枝植原体(SEWB-YNym)和云南元谋芝麻花变叶植原体(SEP-YNym)。两个株系的16S rRNA基因片段长度均为1 248 bp,并且碱基序列完全一致。通过与其他地区报道的芝麻植原体株系16S rRNA基因序列比对后发现这两个株系与来自缅甸的株系不存在位点差异,而与泰国、中国台湾、印度的株系分别存在3~6个位点差异。同时,还从两个株系中获得了长度均为1 171 bp并且碱基序列也完全一致的SEWB-YNym和SEP-YNym的rp基因序列。此rp基因序列包括全部rpl22基因(nt90-476)和部分rps3基因(nt550-1170),分别编码128和206个氨基酸。通过对16S rRNA和rp基因的序列进行同源性比对、构建系统进化树等分析,表明两个株系与候选种‘Candidatus Phytoplasma aurantifolia'相关,为16SrII-A亚组成员,并归属于植原体rp-iii亚进化支。     

云南花生丛枝植原体secY基因序列分析及结构预测

 对采自云南元谋的花生丛枝植株总DNA进行secY基因的巢式PCR扩增,得到约1700bp的特异扩增片段,将该扩增产物克隆后进行序列测定,表明该片段长1709bp,该序列包括部分rpl15基因、全部secY基因序列以及部分的map基因,为植原体部分spc核糖体蛋白操纵子,其中secY基因编码的蛋白包括420个氨基酸,为含有10个明显跨膜区的整合性跨膜蛋白。通过同源性比对及构建的系统进化树,表明该株系与来源于台湾、海南的花生丛枝植原体亲缘关系最近,确定了该株系属于16SrII A亚组成员。该分类结果与基于16SrDNA及rp基因的分析结果一致。     

三七种植土壤中对羟基苯甲酸对尖孢镰刀菌的化感作用

【目的】研究对羟基苯甲酸对尖孢镰刀菌致病性的化感促进作用机制。【方法】采集三七道地产区云南省文山州种植地区不同种植年限的三七根系土壤，采用HPLC技术、宏基因组学技术，结合酶学研究方法，分析对羟基苯甲酸对尖孢镰刀菌的化感作用。【结果】未种植过三七的1年生、2年生、3年生土壤样品中对羟基苯含量不同，分别为3.48、3.95、2.22 mmol/L。自然生长状态下三七种植土壤中对羟基苯甲酸含量随着种植年限的延长而降低，同时伴随着土壤中的尖孢镰刀菌种群密度升高。当土壤中对羟基苯甲酸含量为2.61 mmol/L时，土壤中镰刀菌种群密度最高，为20.94%。随着对羟基苯甲酸含量的增加，土壤中镰刀菌种群密度下降，当其含量为5.11 mmol/L时，镰刀菌种群密度仅为1.057%。中等浓度的对羟基苯甲酸(2.5～5.0 mmol/L)促进尖孢镰刀菌生长，其菌落直径与对照相比升高，菌落颜色在培养24 h后呈现紫色，菌丝生长较对照稍绵密，显微镜下可观察到大量分生小孢子的生成；促进了尖孢镰刀菌果胶酶的活性，其中浓度为2.5 mmol/L时，果胶酶活力为1.02 U/(mL·min);在2.5～10.0 m...