介绍一种奶牛群体高产饲养技术管理方法

一、问题的提出根据中华人民共和国专业标准《高产奶牛饲养管理规范》的规定,高产奶牛饲养分如下五个阶段:干乳期、围产期、泌乳盛期、泌乳中期和泌乳后期。而其泌乳盛期是产奶的最高阶段,也是最难饲养的阶段。奶牛在这个阶段饲养不好,不仅影响整个泌乳期的产奶量,而且会患各种代谢疾病、繁殖疾病,甚至死亡。饲养者最关心的问题是盛乳期奶牛的饲养技术,即如何满足其营养需要,使奶牛     

犬BMSCs复合3D打印支架制备组织工程半月板及体外成软骨诱导时间对其分化的影响

为了制备3D打印犬组织工程半月板支架并评价其性能,探索体外成软骨诱导时间对犬骨髓间充质干细胞(BMSCs)-支架复合物生长分化的影响,本试验使用3D打印技术制备聚己内酯(PCL)半月板支架,肉眼和扫描电镜观察支架形态及微观结构,生物力学试验测定支架压缩模量,使用CCK-8细胞毒性试验评价支架与细胞的相容性,并接种犬BMSCs在体外分别进行成软骨诱导7、14、21、28 d,通过倒置相差显微镜观察细胞在支架上的生长情况,通过测定不同诱导时间糖胺聚糖(GAG)含量和Ⅱ型胶原的表达量,分析和比较不同体外诱导时间对其基质合成的影响。结果显示,3D打印制备出的PCL支架对天然半月板解剖形状的还原度较高,孔隙均匀且孔间连通性好,有一定的力学抗压性能和缓慢的降解速度,接种其上的细胞数量呈递增趋势;在BMSCs-支架复合物的体外诱导过程中,细胞不断增殖,GAG和Ⅱ型胶原合成量都随诱导时间的延长而增加,诱导21 d时的合成量显著高于其他诱导时间的合成量(P0.05)。结果说明,3D打印制备的PCL半月板支架具有良好的理化性能和细胞相容性,有望作为半月板组织工程支架,且体外诱导时间对BMSCs-支架复合物向软骨分化具有重要影响。     

山羊RORα基因的克隆、表达载体构建及功能分析

旨在克隆山羊维甲酸相关孤儿受体α(RORα)基因并构建其真核表达载体,然后利用生物信息学工具系统分析RORα的生物学特性,最后对其在山羊生物钟系统中的作用机制进行初步探究。本研究以1只健康的12月龄雄性西农萨能奶山羊为试验动物,提取其肝组织总RNA,经逆转录PCR反转录为cDNA后,利用常规PCR扩增山羊RORα基因的编码区(coding sequence,CDS)片段,使用同源重组法将其与pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体相连接; 重组载体经PCR、酶切和测序鉴定后,将阳性质粒命名为pcDNA3.1-3HA-gRORα; 将pcDNA3.1-Puro-N-3HA和pcDNA3.1-3HA-gRORα质粒分别转染至HEK293T细胞后,通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)和蛋白质免疫印迹(western blotting,WB)技术检测山羊RORα的表达; 同时利用ExPASy、ProtScale等软件对山羊RORα基因进行系统的生物信息学分析。另外,使用同源重组法分别构建含有山羊生物钟基因BMAL1和NR1D1启动子片段的pGL4.10-BMAL1-Promoter-Luc及pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc的荧光素酶报告质粒,并通过双荧光素酶报告试验探究山羊RORα蛋白调控BMAL1和NR1D1基因启动子转录活性的作用机制。PCR、酶切和测序鉴定结果表明,pcDNA3.1-3HA-gRORα重组质粒构建成功; qPCR和WB结果显示,pcDNA3.1-3HA-gRORα转染组RORα基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平均显著高于pcDNA3.1-Puro-N-3HA转染组(P < 0.01)。生物信息学分析结果显示,山羊RORα基因CDS区序列与绵羊、牛和猪的相似性较高,分别为97.5%、97.1%和95.2%。山羊的RORα蛋白是一种亲水性蛋白。二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成,有信号肽的概率较小,无跨膜区; 三级结构与小鼠和人的RORα蛋白差异性极小,三者具有高度相似性。此外,PCR、酶切和测序结果表明,pGL4.10-BMAL1-Promoter-Luc和pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc重组质粒构建成功。双荧光素酶报告试验结果表明,山羊RORα蛋白可以显著上调山羊BMAL1和NR1D1基因启动子的转录活性。本研究成功构建了山羊RORα基因的真核表达载体,并证明了RORα蛋白可以正向调控山羊BMAL1和NR1D1基因的启动子活性,这为进一步探究山羊核受体RORα的功能及山羊生物钟的转录调控机制提供了前期基础。     

钻孔法增加犬半月板脱细胞基质支架孔隙率的可行性分析

为增加半月板脱细胞基质（MAM）支架的孔隙率，提高细胞植入量，笔者对犬半月板先行钻孔，再行脱细胞处理，然后检测支架的脱细胞效果、孔隙率和力学性能变化、细胞植入量及与犬骨髓间充质干细胞（BMSCs）向软骨诱导培养后糖胺聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的表达情况。结果显示，钻孔支架的脱细胞效果良好，未见细胞核，胶原纤维结构完整；支架的孔隙率显著增大，但压缩模量变化不显著；BMSCs在钻孔支架中的植入量显著增加，细胞增殖速度和向软骨分化能力显著提高。结果表明，钻孔法增加半月板基质支架的孔隙率，不但能保持支架的力学性能、提高细胞的植入量，而且能促进细胞的增殖、分化和组织重塑，为MAM支架在组织工程半月板构建中的广泛应用奠定了基础。     

山羊生物钟基因CLOCK真核表达载体的构建和生物信息学分析

试验旨在构建山羊昼夜运动输出周期蛋白(circadian locomotor output cycles kaput,CLOCK)基因真核表达载体,系统分析山羊CLOCK蛋白的生物学特性。从山羊卵巢组织中提取总RNA,反转录成cDNA后经PCR扩增山羊CLOCK基因CDS区序列,并以同源重组的方式将其连接至pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体;经PCR、酶切和测序鉴定后,将阳性质粒命名为pcDNA3.1-3HA-gCLOCK;将pcDNA3.1-Puro-N-3HA和pcDNA3.1-3HA-gCLOCK质粒分别转染至HEK293T细胞中,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测山羊CLOCK基因的表达效果,并对山羊CLOCK基因进行系统的生物信息学分析。结果显示,山羊CLOCK基因CDS区片段长2 538 bp,将其与线性化的pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体重组连接并通过酶切和测序鉴定后,成功构建了pcDNA3.1-3HA-gCLOCK真核表达载体;实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,pcDNA3.1-3HA-gCLOCK转染组CLOCK基因在mRNA和蛋白水平的表达量均极显著高于pcDNA3.1-Puro-N-3HA对照组(P<0.01)。生物信息学分析结果表明,山羊CLOCK基因CDS区序列与绵羊、牛和马的相似性分别为99.4%、98.7%和95.6%。山羊CLOCK蛋白是一种不稳定蛋白,具有一定的亲水性,无跨膜区和信号肽。二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成;三级结构与小鼠和人的CLOCK蛋白相比具有极高的相似性。本研究成功构建了山羊生物钟基因CLOCK真核表达载体,并进行了生物信息学分析,为进一步研究山羊CLOCK基因的生物学功能及山羊生物钟的转录调控机制提供了材料。     

奶牛CRY1基因真核表达载体构建、生物信息学分析及组织表达谱研究

【目的】扩增奶牛隐花色素昼夜节律调节因子1(cryptochrome circadian regulator 1,CRY1)基因全长编码区(coding sequence, CDS),构建该基因的真核表达载体并对其进行生物信息学分析,检测奶牛CRY1基因的表达谱,为后续探究CRY1蛋白的生物学功能提供参考。【方法】以奶牛肝脏组织cDNA为模板,PCR扩增CRY1基因CDS区,将其与酶切线性化的pcDNA3.1-3HA空质粒以同源重组法连接,重组质粒命名为pcDNA3.1-3HA-cCRY1;利用在线软件对奶牛CRY1基因进行生物信息学分析。将空质粒pcDNA3.1-3HA和重组质粒pcDNA3.1-3HA-cCRY1转染至HEK293T细胞,利用Western blotting技术检测奶牛CRY1基因在蛋白水平的表达;利用实时荧光定量PCR检测CRY1基因在奶牛不同组织中的表达量。【结果】试验成功获得1 764 bp的奶牛CRY1基因CDS区序列,且成功构建pcDNA3.1-3HA-cCRY1真核表达载体。奶牛CRY1基因与牦牛、山羊、绵羊相似性在98%以上,且遗传距离较近。生物信息学...     

小鼠Nr1d1基因生物信息学分析及其慢病毒干扰载体的构建

[目的]研究旨在分析小鼠Nr1d1基因序列信息及其所编码蛋白的结构和功能,构建并筛选出干扰效率最优的小鼠Nr1d1基因慢病毒干扰载体.[方法]对小鼠Nr1d1核苷酸序列和氨基酸序列进行生物信息学分析;设计合成4对小鼠Nr1d1基因的特异性shRNA序列和1对无义序列;分别将它们连接至pCD513B-U6慢病毒干扰载体上...     

小鼠RNA结合蛋白QKI-5的生物信息学和组织表达分析及其过表达对癌症相关基因表达的影响

【目的】旨在构建小鼠Quaking基因的主要转录本Quaking-5(Qki-5)的真核表达载体，利用生物信息学软件预测分析其结构与功能特征，检测该基因的组织表达谱，并在小鼠AML12肝细胞系中探究Qki-5过表达对癌症相关基因表达的影响。【方法】提取小鼠肝脏组织的总RNA，反转录为cDNA，通过PCR扩增Qki-5转录本的蛋白编码区（Coding Sequence,CDS）全长，将获得的目的片段与线性化载体pcDNA3.1-Puro-N-3HA进行同源重组连接以获得pcDNA3.1-m Qki-5。通过在线软件对Qki-5基因序列及其编码蛋白进行生物信息学分析，并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Qki-5基因在小鼠不同组织中的表达谱，同时使用免疫组织化学技术检测QKI-5蛋白在小鼠肝脏组织的表达分布。之后，将pcDNA3.1-m Qki-5重组质粒和pcDNA3.1-Puro-N-3HA空质粒分别转染至AML12细胞，通过qPCR和Western Blotting(WB)检测Qki-5基因在mRNA和蛋白水平的表达，并进一步检测Qki-5基因在AML12细胞中过表达后对癌...